武延生,邢翠娟,李 敏,武丽娜,牛伟涛,张鹏飞,王僧虎

(1.邢台学院生物科学与工程学院，河北 邢台 054001；2.邢台学院河北省邢枣仁利用技术创新中心，河北 邢台 054001；3.邢台学院邢台市药用植物工程技术研究中心，河北 邢台 054001)

酸枣(Ziziphusjujubavar.spinosa)又名野枣、山枣、棘，鼠李科(Rhamnaceae)枣属(Zizyphus)落叶灌木或小乔木，偶见高大乔木，在我国广泛分布，在太行山区为常见物种，可生在荒坡、沟边、路旁、沙砾、石缝中，在水分、营养物质丰富的地方生长更盛。酸枣产业已成为邢台地区山区县市的主要产业，作为发展国民经济、改善生态环境、丰富人民生活的重要战略措施在各级政府和不同组织机构得以贯彻实施。目前对酸枣的开发利用是基于已有酸枣种质资源开展的[1-3]，有关生理生化研究多是在全株或组织器官水平上进行[4-6]。在细胞水平、细胞器水平甚至分子水平上对酸枣加以改良或深入的生理、生化研究是酸枣产业发展和科学研究的必然要求和重要发展趋势。原生质体由于去除了细胞壁，质膜暴露在外，易于摄取细胞器、病毒、细菌和核酸，可以进行显微注射、细胞融合[7]，为细胞转化、品种改良、杂交品系建立以及进一步探索细胞生命活动特性有非常重要的意义。相较于其它材料，由于种子下胚轴和幼根材料易得、分化程度低、易于诱导分化、细胞壁薄，成为制备原生质体的理想材料，世界上第一个获得的原生质体就是以幼根材料制备的[8-9]。通过酸枣幼根原生质体制备方法探索，为酸枣育种、基因工程的开展和细胞生理研究奠定基础。

图1 酸枣种子的处理和萌发过程

表1 不同酶解液成分对酸枣幼根原生质体制备的影响

1 材料和方法

1.1 试验材料、药品

“邢州10号”酸枣种子，由河北邢州枣业有限公司提供。

纤维素酶R-10、纤维素酶RS、果胶酶均为Japan Yakult 公司产品，甘露醇为国产分析纯试剂。

1.2 酸枣萌发幼根

选择籽粒饱满、无机械损伤的种子，在75%酒精中浸泡5 s进行表面消毒，用无菌水洗净[10]，然后，置于底部铺有4～6层纱布的培养皿中，每皿10～15粒种子，将纱布用无菌水打湿，种子上面覆盖一层用无菌水湿润的滤纸。在培养过程中，保持滤纸纱布湿润但不被水淹没。用铝箔纸包裹，置于25 ℃恒温培养箱中。

2 试验结果与分析

2.1 酸枣幼根的预处理

将酸枣种子培养5～8 d，待幼根生长到1 cm左右时(图1)，切取幼根根尖下部包括分生区的根段，用滤纸吸干表面水分，在载玻片上，用刀片切成长1 mm左右的切段，放入EP管中。刀片力求锋利，避免在切割时挤碾压破细胞。在EP管中事先加入1 mL含0.7 mol·L-1甘露醇、pH 5.5～6.0的缓冲液，于黑暗处静置1 h进行质壁分离预处理。

2.2 预试验

将幼根切块质壁分离处理后，加入果胶酶、纤维素酶R-10、纤维素酶RS，制成不同浓度组合的酶解液(表1)，轻摇使之混匀，置于28 ℃恒温水浴中，酶解期间每0.5 h在显微镜下观察原生质体状况，直到原生质体的数目不再增加，此时可认为酶解完成。试验结果显示，果胶酶浓度从0.5%增加到1%时，原生质体产量明显增多，但浓度增加到2%时，原生质体产量没有明显增加，细胞碎片开始增加；纤维素酶R-10的浓度从1%增加到3%时，原生质体产量不断增加，浓度由3%增加到4%时，原生质体产量没有明显增加；纤维素酶RS的浓度从1%增加到3%时，原生质体产量不断增加，浓度由3%增加到4%时，原生质体产量没有明显增加(表1)。试验结果表明，果胶酶的最适浓度为1%左右、纤维素酶R-10的最适浓度为4%左右、纤维素酶RS的最适浓度在3%左右。

2.3 正交试验

根据预试验结果，继续采用三因素三水平的正交试验法进行深入研究。三因素为果胶酶、纤维素酶R-10、纤维素酶RS。每个因素设三个水平，分别为果胶酶浓度分别为0.5%、1%、1.5%，纤维素酶R-10的浓度分别为3%、4%、5%，纤维素酶RS的浓度分别为1%、2%、3%。酶解完成时，将酶解液放入台式低温离心机，4 ℃、3 000 r·min-1离心5 min，弃去上清液，加入1 mL缓冲液，重复离心洗涤3次，置于显微镜下观察原生质体状况。根据离心后原生质体产量、所需酶解时间、细胞碎片数三个指标确定最适酶浓度组合，根据L9(34)正交试验确定最适酶浓度组合为1%果胶酶、4%纤维素酶R-10、3%纤维素酶RS(表2)。

表2 不同浓度酶解液制备酸枣幼根原生质体的正交试验

注：箭头所指为原生质体。图2 显微镜下酸枣幼根细胞原生质体(10倍)

3 讨 论

3.1 材料的选择和预处理

植物幼根根尖包括根冠、分生区、伸长区、成熟区四个部分，分生区细胞分化程度低，细胞小而核相对大、质浓，尤为重要的是细胞壁薄，主要成分为果胶质和纤维素，不含木质素。而根冠、伸长区、成熟区的细胞有一定程度的分化，小液泡融合，体积增大，细胞质所占比例降低[11]。因此，从酶解的便利性和原生质体的可实用性上来看，分生区细胞是最为理想的原生质体制备材料。在本研究中，格外注意截取的幼根长度，不可过长，尽量少截取伸长区，避免截取到成熟区，而根冠部分由于与分生区部分难以分清，细胞数目不多，在试验中未予重视。

大量研究表明，进行质壁分离处理可扩大细胞壁内表面积，从而增加水解酶的接触面[12]，可切断胞间连丝[13]，提高酶解效率[14-16]。在本研究中，在酶解处理前，对切碎的幼根进行了质壁分离预处理，在其后的酶解处理中，对质壁分离效果未做进一步研究。

3.2 水解酶浓度的确定

果胶酶可降解连接细胞壁的中胶层，使细胞从植物组织上游离出来；纤维素酶降解细胞壁而使原生质体释放。因此，一般采用纤维素酶和果胶酶的混合液来降解细胞壁制备原生质体。在一定范围内，酶的作用效果随浓度的增加而增加，当酶浓度超过一定范围时，导致细胞碎片增多，酶解效果下降[16]，所以选择合适的酶浓度对于原生质体的制备很重要。本研究首先结合文献报道[7,10,17]，通过预试验初步确定酶最适浓度范围，再用正交法高效、准确地确定酶的最适浓度。

在一定范围内，原生质体分离的速度随酶解液浓度的增加而增加，但当酶浓度过高时，会使细胞碎片增多而影响原生质体的质量(表1、表2)。预试验中，当果胶酶浓度从0.5%增加到1%时，原生质体产量明显增多，但当浓度增加到2%时，原生质体产量没有明显增加，细胞碎片开始增加(表1)。综上，在28 ℃水浴条件下，在含0.7 M甘露醇、pH 5.5～6.0的缓冲液中质壁分离预处理1 h，当加入水解酶的组合为1%果胶酶+4%纤维素酶R-10+3%纤维素酶RS时，制得的酸枣幼根原生质体产量较高、细胞碎片较少、速度快，为制备酸枣幼根原生质体较合适的条件。