侯莎，吴昌正，童星*

(1.佛山市海天调味食品股份有限公司，广东 佛山 528000；2.广东海天创新技术有限公司，广东 佛山 528000)

米曲霉(Aspergillusoryzae)是半知菌亚门丝孢纲丝孢目从梗孢科曲霉属中的一个常见种，在自然界中分布广泛，主要分布于粮食、发酵食品、腐败有机物和土壤中。米曲霉具有强大的蛋白分泌能力，能够分泌蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶和果胶酶等，被广泛应用在酱油、豆豉、黄豆酱等多种发酵调味品的生产中。同时也是多种食品用酶制剂的生产菌株。经过多年实践检验，其安全性被国内外普遍承认，更被美国FDA认定为公认安全的菌株(generally recognized as safe， GRAS)。

米曲霉等丝状真菌在环境中分布十分广泛，与人类的生活息息相关，在医疗实践、农业生产及基础生物学研究等方面扮演着十分重要的角色。丝状真菌具有丰富的次级代谢网络，其产物在医药领域具有相当的探究价值，包括有重要应用价值的抗生素、抗癌物质、降血脂药物、免疫抑制剂等[1]。米曲霉基因组相比同属的大30%左右，拥有更为活跃的代谢网络。次级代谢是一个复杂的、多层次的调控过程，不仅受途径特异性转录因子的调控，也受到全局性调控因子的控制，又与环境因子的影响密切相关。研究米曲霉次级代谢途径，破译其调控网络，对于高效获得具有应用价值的次级代谢产物，指导米曲霉的工业应用具有重大意义。

1 米曲霉的次级代谢产物

2005年，第一株米曲霉基因组由26家日本科研单位合作破译，基因组大小为37 Mb，共有8条染色体，注释12074个基因[2]。其大小相比同属的构巢曲霉和烟曲霉分别大29%和34%，在水解酶分泌、氨基酸代谢和糖类转运方面具有更为丰富的基因和通路，这为米曲霉产生丰富的次级代谢产物提供了基因基础[3]。

米曲霉的次级代谢产物中不乏具有生理、药理作用的活性成分，这些产物在米曲霉的进化及与其他生物和环境的相互作用密不可分。例如在化妆品中广泛使用，具有美白抗氧化作用的曲酸[4]，不仅是多种美白产品的主要功能成分，还是头孢类抗生素的原料，具有抑制酪氨酸氧化酶、多酚氧化酶、黄嘌呤氧化酶的作用。1990年Fefferle W P等从来源于土壤的一株米曲霉中分离获得Asperfuran物质，研究发现其具有抗真菌活性[5]。Oryzachlorin于1969年从米曲霉中被分离，能够强烈地抑制酵母菌的生长，但对细菌和丝状真菌却没有抑制作用[6]。Aspergillomarasmine B，1965年Haenni等从米曲霉中分离出能够影响植物原生质体的渗透压，在后来的研究中也发现该物质对于血管紧张转换酶和内皮素转换酶具有抑制作用[7]。聂丽娟从米曲霉的菌丝体及培养液中分离鉴定出12种化合物，其中1个全新化合物，并发现其中4种对神经细胞具有保护作用和增殖影响，1种化合物对氧化损伤的SH-SY5Y细胞具有保护作用，3种化合物对金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌和大肠杆菌具有抑菌活性，并且发现菌丝体提取物对于金黄色葡萄球菌具有显著的抑制作用[8]。被发现和报道的化合物只是米曲霉次级代谢产物的一小部分，更多活性分子仍有待发掘、验证和开发应用。

2 米曲霉的次级代谢途径的转录调控

丝状真菌次级代谢产物的合成与调控是复杂的过程，涉及多步酶促反应，一般合成基因聚集成簇[9]，受到途径特异性调控因子和全局性调控因子的双重调控，又有表观遗传在其中发挥关键作用，同时也与温度、湿度、营养条件等环境因子密切相关。米曲霉具备典型的次级代谢调控网络，在转录过程、表观遗传以及环境因子等不同水平上均有多种蛋白质参与，形成复杂的多重调控系统。

2.1 途径特异性调控因子

途径特异性调控因子是次级代谢途径功能基因表达的最直接调控方式，50%次级代谢途径含有途径特异性调控因子，一般位于基因簇内部。途径特异性调控因子具有典型的转录因子的结构组成，包含DNA结合域和转录激活域。丝状真菌的途径特异性转录因子的DNA结合域包含一个典型Zn(II)2-Cys6模体，能够识别存在于功能基因的启动子区域中的一段特异性回文序列[10]，因此途径特异性调控因子能够结合在功能基因的启动子区域，并由转录激活域招募通用转录因子完成转录激活。一般认为途径特异性转录因子只能调控所在基因簇的表达，但是近来研究也发现有的还能调控其他途径甚至多个途径，使得不同途径之间存在相互作用，次级代谢调控在最基础的调控中也存在交叉与互作，其调控网络的复杂程度可见一斑[11]。

除了有活性分子外，丝状真菌的一部分次级代谢产物存在一定的生物风险，比如黄曲霉毒素(aflatoxin， AF)，主要由黄曲霉和寄生曲霉产生。值得一提的是，米曲霉虽然在种属上与黄曲霉接近，但是却从没有检测到黄曲霉毒素的产生[12]，这是由于米曲霉的黄曲霉毒素基因簇中存在着大片段缺失和多处突变所导致的[13]。其中途径特异性调控因子aflR就存在多处突变，在有些米曲霉中aflR并不表达，有些能检测到微弱表达[14]，但项目组通过RNAseq分析并用RT-PCR验证发现大部分AF功能基因并未获得表达(数据未公开发表)，这为米曲霉的安全性又增添了新的证据。

2.2 全局性调控因子

除了途径特异性调控因子，米曲霉次级代谢途径的转录调控还受到全局性调控因子的正向或负向调控，例如pH调控因子PacC、CreA，氮源调控因子AreA等。近年来研究最为广泛的是受光照负调控的Velvet复合物，由LaeA、VeA、VelB 3个蛋白组成，对多种次级代谢途径具有正向调控作用。主要蛋白LaeA是Bok等于2004年在构巢曲霉中发现的，启动子和开放阅读框中含有3个aflR结合序列和能够参与组蛋白甲基化的S-腺苷甲硫氨酸结合序列[15]。LaeA不仅是组成Velvet三聚体主要的蛋白，能够控制曲霉有性生殖和无性生殖的转换，也是调控VeA、VelB及相关因子表达的关键因子。关于LaeA的作用机理，目前并没有定论，可能的途径有3种：一是通过组蛋白甲基化调控下游基因的表达；二是通过与途径特异性调控因子的反馈调节作用控制次级代谢途径功能基因的表达；三是通过G蛋白信号转导途径调控次级代谢与形态分化[16]。

此外，与分生孢子梗发育相关的C2H2转录因子BrlA也被证明具有次级代谢调控的功能，尤其是与孢子产生相关的代谢调控。BrlA缺失突变与无性孢子产生异常密切相关[17]。

Arakaug等于2019年通过米曲霉突变库鉴定出一个Zn(II)2-Cys6型转录因子KpeA，具有全局性调控的功能，参与孢子发生和次级代谢调控。KpeA的缺失突变降低了无性孢子发生的核心调控因子BrlA的表达，在固体培养基上表现出气生菌丝更长、分生孢子减少的表型。此外，相比对照菌株，KpeA突变株的曲酸含量提升了6倍，原因是在KpeA突变株中曲酸合成的途径特异性调控因子KojR的表达得到了显著提升。在LaeA缺失突变株中并没有发现KpeA表达量的变化，证明KpeA的调控作用并不是通过LaeA途径实现的[18]，也印证了KpeA全局性调控因子的身份。全局性调控因子是米曲霉次级代谢网络响应外界刺激的纽带，提升了细胞在不同环境中的适应性。

2.3 表观遗传调控

途径特异性调控因子通过直接招募通用转录元件来启动次级代谢基因的表达，全局性调控因子通过途径特异性调控因子来影响功能基因的激活，而表观遗传调控则是通过染色体的结构变化来间接影响转录因子或者功能基因的表达，调控方式包括DNA甲基化、组蛋白乙酰化、甲基化和泛素化等，其中通过组蛋白修饰实现染色质结构重塑的研究最为广泛。Kawauchi等鉴定出米曲霉中与酵母hst4同源的HstD基因，发现当HstD缺失时，米曲霉的生长受到影响，但是曲酸的合成量却增加了近200倍，青霉素的产量也有显著提升。进一步研究发现，HstD基因缺失的菌株中LaeA蛋白表达量上升，随即引起下游代谢通路基因的高表达，最终导致代谢产物产量的提升[19]。

除了组蛋白乙酰化外，甲基化也是影响基因表达的关键修饰。Shinohara等在米曲霉中发现了与构巢曲霉cclA同源的基因和与酿酒酵母sppA同源的基因。CclA是组蛋白H3K4甲基化转移酶复合物的组成部分，而SppA是与H3K4甲基化转移酶相关的另一复合物的重要组成部分。这两个基因的缺失影响了组蛋白H3K4的三甲基化，导致染色体状态发生变化，影响相关区域基因的表达，最终导致次级代谢产物astellolide F产量的提升[20]。表观遗传调控在次级代谢调控网络中是比全局性因子更上游的调控方式。

2.4 环境因子的调控

米曲霉中次级代谢途径基因的转录调控和表观遗传调控均是响应环境刺激的结果，因此环境刺激对于次级代谢产物的产生十分重要。碳源、氮源、温度、湿度、光照等这些环境因子均能引起米曲霉次级代谢的变化，而这种变化也是通过细胞内的转录因子或信号转导来实现。例如，pH的影响通过调控因子PacC、CreA来介导，氮源的影响通过AreA来介导，高温和光照能够抑制Velvet复合物的活性，从而导致下游通路的表达减弱等。

环境因子的调控涉及的次级代谢通路更为广泛，往往一种因子的变化通过细胞内信号通路的逐级放大，对多个代谢途径产生影响。PARK等利用GC-TOF/MS与GC-MS联用的方法检测在合成培养基中不同温度、不同pH、不同时间培养米曲霉所产生的代谢产物，发现46种初级代谢产物、76种次级代谢产物发生变化。存在变化的次级代谢产物包括支链脂质挥发性成分、苯系物等。直链挥发性脂质成分在高温下显著降低，而在低pH条件下呋喃类化合物的产生则显著提升，这体现出不同的次级代谢途径对不同环境因子的响应程度和方式并不相同[21]。

3 次级代谢产物的提升

活性次级代谢产物在原始菌株中的产生量往往并不丰富，加之复杂的提取工艺带来的损失，导致活性成分的综合得率很低，难以进行推广应用。因此通过菌种选育、环境因子代谢调控和基因工程改造实现活性成分含量的提升，是米曲霉活性化合物走向应用的重要一环。

3.1 菌种选育

在工业应用中，目标分子产量的提升主要依赖传统诱变的方法，诱变方法包括化学诱变、紫外诱变、微波诱变、N+离子注入诱变及常压室温等离子体诱变(ARTP)等方式。诱变的育种方式更容易被消费者所接受，对于研究并不深入的代谢通路，能够快速获得产量提升的菌株，同时也能产生丰富的突变为代谢通路的调控研究提供了资源。但诱变产生的基因变化具有随机性，如何从大量的突变株中筛选出目标产物提升的菌株是整个过程的关键，也是限制诱变育种效率提升的重要瓶颈。

对于米曲霉来说，如何筛选优质菌株的问题更为突出，除了目标性状筛选方法建立较难之外，通量化筛选更是面临诸多瓶颈。米曲霉是丝状真菌，液体培养时形成菌丝球，并不是分散的单细胞，难以通过在酿酒酵母或细菌中广泛应用的微流控系统配合流式分选的方式进行通量筛选；固体培养状态下也因菌丝蔓延导致交叉污染而难以实现通量化。舒冬梅等通过半固态培养基实现15株米曲霉的复筛是米曲霉通量筛选的首次公开报道，但是其筛选通量仍有待提高[22]。Feng等通过96孔板液体培养，获得曲酸含量提升近3倍的米曲霉菌株[23]，但液态培养均一性及与工业应用场景的匹配性仍需进一步研究。因此，米曲霉的高通量筛选方法目前尚未形成稳定的技术，仍需科研工作者针对米曲霉的生长和应用特性进行深入研究，建立匹配工业应用场景的稳定方法。

3.2 环境因子代谢调控

以全局性调控因子及表观遗传调控为分子基础，次级代谢途径能够响应多种环境因子的刺激，包括活性氧、碳源、氮源、温度、湿度、光照、pH值等。因此，通过控制培养条件能够最大程度激活功能基因的表达，引导细胞内的物质和能量向目标代谢通路转移，获得目标产物产量的提升[24]。环境因子的调控往往与代谢组学研究相结合，通过代谢组学方法发现与特定产物密切相关的环境因子，然后通过最陡爬坡法、响应面法对各个因素进行优化，获得最佳的培养条件。

3.3 基因工程手段菌种改造

随着测序技术及生物信息学分析技术的进步和人们对大数据处理能力的不断增强，米曲霉功能基因组的研究迅速发展，加之CRISPR基因编辑系统的逐步完善，米曲霉的遗传操作技术越发成熟，为利用基因工程和代谢工程来提高米曲霉次级代谢产物的产量提供了基础。Tamano等在阻断曲酸合成途径的米曲霉中引入由kojA启动子驱动表达的多酚合成酶，实现多酚的持续产出[25]。Shinohara等发现当染色质重塑因子cclA和sppA突变时，次级代谢产物astellolide F产量显著提升。基因工程改造具有明显靶向性，往往能够在最短时间获得较好的产量提升效果，但是往往依赖于遗传操作系统的成熟度和代谢通路的前期研究基础[26]。同时，基因工程育种需要关注菌株的生长状况及与生产工艺的匹配性等问题，此外，在食品领域的应用仍受到一定限制。

4 结语与展望

在丝状真菌的次级代谢研究中，米曲霉的研究基础相对薄弱，原创性突破较少，深入而系统的研究更少，而且日、韩两国的研究广度和深度均超过我国。主要原因有两点：一是米曲霉的遗传操作并不十分成熟，调控机理的体内验证耗时费力；二是我国学术研究与工业应用之间的衔接并不顺畅，研究成果与工业需求并不匹配或者在工厂中难以复制和推广，导致学者失去深入研究的动力。随着技术的不断发展和我国科技制度的改革，这些问题有望被逐渐克服，我国的米曲霉次级代谢研究也将会越来越系统和深入。

米曲霉次级代谢的多层次调控，其核心在于功能基因的表达调控，细胞外环境因子和细胞内基因的变化都将通过染色质结构、信号转导及转录因子的变化，最终汇集到功能基因表达的调控上，形成环境刺激、表观遗传变化、全局性调控因子响应、途径特异性调控因子作用、功能基因表达的多层次调控网络。代谢组学在其中也发挥着重要作用，相比初级代谢，次级代谢对于胞内物质、能量、还原力等因素更为敏感，通过代谢调控能够实现胞内物质变化和能量转移向目标途径倾斜，实现次级代谢产物产量的提升。随着基因组学、转录组学和代谢组学的发展及米曲霉遗传操作技术的成熟，次级代谢调控因子将逐步被发现和解析，调控机理也将会被慢慢揭示。对米曲霉次级代谢调控网络认知的逐步深入，能够有效指导人们更加合理地应用米曲霉的次级代谢产物，拓展米曲霉的工业应用范围和场景。