冯江浩，魏思昂，闫丽欢，崔 洁，冯 焱*

(1.山西农业大学生命科学院，山西太谷 030801；2.山西省太原市食品药品检验所，山西太原 030000)

基因编辑技术是分子生物学研究中的重要手段，通过对目的片段序列的改变，从而影响基因的功能。它的出现推进分子生物学的进程，提高了对于基因结构功能的研究效率。目前基因编辑的主要手段有3种，包括锌指核酸酶 (zinc finger endonuclease，ZFN)技术、转录激活因子样效应物核酸酶 (transcription activator-like effector nuclease，TALEN)技术和CRISPR/Cas9技术[1]。其中ZFN由于构建繁琐，逐渐被TALEN和CRISPR/Cas9所取代。CRISPR/Cas系统是细菌和古细菌中对于外源DNA的一种防御机制，主要功能是对外源侵入的噬菌体以及外源质粒进行切割，破坏DNA结构，使其失去活性，无法转录以及翻译蛋白对自身产生影响。CRISPR/Cas系统最早于1987年被发现有规律的重复序列，这些重复序列与噬菌体内序列高度同源。Ⅱ型Cas9有核酸内切酶活性[2]。在小鼠上实现基因编辑操作，将CRISPR/Cas9应用于实际操作[3]。与TALEN相比，CRISPR/Cas9具有更加简单的构建过程和高效的剪切效率，但脱靶效应也是限制其发展的核心问题之一。近年来CRISPR/Cas9基因编辑技术广泛用于构建动物模型以及细胞层面的研究。

1 CRISPR/Cas系统组成

1.1 CRISPR/Cas结构与分类

CRISPR/Cas系统依Cas蛋白的不同可分为2个大类，5个亚型[4]。其中Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ为第1类，Ⅱ、Ⅴ为第2类[10]。CRISPR/Cas系统分为CRISPR序列和Cas蛋白，CRISPR序列是一段DNA序列，由多个重复的单元构成，每个单元由一段长度为24 bp～48 bp的高度保守的重复序列和26 bp～72 bp的间隔序列组成，称为簇状短回文间隔重复序列[5]。间隔序列是与外源DNA同源的序列，通过转录CRISPR-derived RNA(crRNA)指导Cas蛋白对目的序列的匹配。……