郭宏伟，赵绪永，李华玮，张 震，马 辉，郑 鸣

(河南牧业经济学院，河南郑州 450011)

1985年，美国科学家Kary Mullis发明了聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)技术，使得在体外条件进行核酸片段的无限扩增成为可能，但是该方法存在操作繁琐、交叉污染风险较高等不足。1992年，实时荧光定量PCR的诞生不仅一定程度上避免了传统PCR技术的缺陷，还能够通过荧光信号、Ct值和靶基因的起始浓度3个参数实现对扩增产物或基因的表达水平进行定量分析。但是，由于实时荧光定量PCR技术的绝对定量依赖于Ct值和标准曲线，使得所谓的“绝对定量”在一定程度上只是相对的。同时，尽管实时荧光定量PCR在敏感性上能比传统PCR技术提高至少1个数量级，但是对于低拷贝的靶基因、模板差异倍数不大的情况下，实时荧光定量PCR技术的检测敏感性和精确度会受到限制。随着低丰度样品检测、基因突变检测应用需求的日益增加，真正可以实现绝对定量的数字PCR技术应运而生[1]。本文主要针对数字PCR的发展历史、技术原理、与实时荧光定量PCR相比的优缺点以及在动物疫病诊断中的应用等方面进行综述，以期为提升动物疫病分子诊断能力提供借鉴。

1 数字PCR的发展历史

1999年，美国约翰·霍普金斯大学的Vogelstein B等[2]首次提出了数字PCR(digital polymerase chain reaction)的概念，并在96孔板和384孔板上实现对结肠癌的致癌突变基因Kras进行了定量分析。但是此时的数字PCR方法是比较原始的、需要大量手工操作的劳动密集型技术，难以广泛应用[1]。随着微流体技术和纳米制造技术的进步，数字PCR技术也迎来了突破技术瓶颈的契机。……