陈大嵩，黄 鸿，吴 华，李健雄，戴建青

(广东省科学院动物研究所，广东省动物保护与资源利用重点实验室，广东省野生动物保护与利用公共实验室，广州 510260)

蓖麻蚕Samiaricini，又叫惠利蚕、木薯蚕，大蚕蛾科Saturniidae樗蚕属的驯养绢丝与食用的非滞育经济型昆虫。原产于印度东北部的阿萨姆邦，由宽带樗蚕Samiacanningi驯化而来(Peigler & Calhoun, 2013)。我国自1951年，由中国科学院实验生物研究所朱洗教授引进饲养蓖麻蚕。蓖麻蚕茧壳奶白色，可用于生产绢纺原料，为全世界仅次于家蚕与柞蚕的第三大绢丝昆虫，其蚕丝质量仅次于家蚕BombyxmoriLinnaeus并优于柞蚕AnthereapernyiGuerin-Meneville (van Beeketal., 2000)，蚕丝可设计成优良的生物材料与细胞支撑介质(Paletal., 2013)，其熟蚕与蛹亦是优质昆虫食品(Longvahetal., 2011)，蚕蛹油脂可提炼优质健康的食用油(王卫飞等, 2018)，卵可繁殖多种寄生蜂(莫现会等, 2016)。蓖麻蚕即可室内饲养亦可放养，除家蚕外，为仅有的几种可以在室内大量圈养的绢丝昆虫。蓖麻蚕的寄主植物相较家蚕与柞蚕更广，一般以大戟科的蓖麻与木薯做饲料大量饲养，替代寄主包括大戟科的乌桕Sapiumsebiferum(L.)Roxb.、夹竹桃科的鸡蛋花Plumeriarubra、苦木科的臭椿Ajugalupulina、马桑科马桑CoriarianepalensisWall.、芸香科吴茱萸Euodiaruticarpa、菊科的蒲公英TaraxacummongolicumHand.-Mazz.和莴苣LactucasativaL. var. angustanaIrish.等。以蓖麻-蓖麻蚕与木薯-蓖麻蚕的形式进行栽培-养殖的联合增加了蓖麻与木薯的产值，是带动蓖麻与木薯种植业的重要因素之一。

蓖麻蚕生产上可能遭受侵害的毁灭性病害包括蓖麻蚕微粒子病(刘士贤等, 1964；谢伟东, 1989)、脓病(叶育昌, 1982；李敏棠等, 1985)、软化病等(吴汝章, 1987)，甚至同时感染多个疾病。此外，被污染的蚕室、蚕具、蚕卵很易残留病原，且随着累代对病原物的不停积累，蚕病会呈现愈发严重的趋势并且病原物亦愈发难以清除。目前常用的分子生物学检测蚕病病原手段包括PCR、实时荧光qPCR、环介导等温扩增LAMP、巢式PCR等方法。随着高通量测序方法的发展，测序成本的不断降低，高通量检测方法被广泛应用在各种病原的检测中。在各高通量测序平台中，牛津纳米孔公司Oxford Nanopore的掌上纳米孔测序仪MinION是一款便携式测序仪，能够直接进行DNA和RNA测序，拥有超长的读长、实时测序、随时终止等特性，被广泛应用在检测多种病原体中(Warwick Dugdaleetal., 2019；Wongsurawatetal., 2019)。本文通过利用MinION测序仪对蓖麻蚕病蚕组织样品的DNA进行测序，鉴定病蚕感染的病原物，以实现利用高通量测序技术对蓖麻蚕疾病进行监控。

1 材料与方法

1.1 DNA提取

蚕病取自江苏省南京市蚕农的蚕室，接种于实验室内饲养的蓖麻蚕1龄幼虫，接种后至2～3龄幼虫集体发病，幼虫脱离寄主、拒食、拉稀，死后呈现发黑、软化等症状，死后蚕体整体用于DNA提取以获得足够量的起始DNA浓度。待测蚕体首先在80℃孵育5 min以杀灭病原以防交叉污染，每1 g蚕体组织放于10 mL CTAB裂解液(2% CTAB，100 mM Tris (pH 8.0)，20 mM EDTA，1.4 M NaCl，3%疏基乙醇)中研磨，65℃水浴2 h。待降温至室温，加入等体积的酚氯仿异戊醇(25 ∶24 ∶1)萃取，震荡10 s后离心10 min，取上清液重复上一步再次加入等体积的酚氯仿异戊醇萃取。上清液加入等体积的异丙醇沉淀DNA，颠倒混匀后，离心10 min。弃上清留取DNA沉淀，加入适量70%乙醇清洗DNA，离心5 min后弃上清并用移液器吸干液体，晾干DNA后加入100 μL无菌水溶解DNA。

1.2 纳米孔测序文库构建

DNA溶液经过微量分光光度计测量DNA含量，取2 μg DNA溶液加入Covaris g-TUBE打断管上部，8 500 r/min离心1 min将DNA溶液离心到下部，颠倒后8 500 r/min离心1 min将DNA溶液重新离心到上部，DNA溶液取出1 μL加入微量分光光度计测量DNA含量并保证1 μg以上的DNA用于下一步实验。利用末端修复试剂盒(NEBNext End repair / dA-tailing Module，E7546)对打断的DNA进行末端修复，利用磁珠(AMPure XP beads)对DNA文库进行回收，取1 μL文库加入微量分光光度计测量DNA含量并保证700 ng以上的DNA用于测序。利用末端连接试剂盒(NEB Blunt/TA Ligase Master Mix，M0367)把连接测序试剂盒(1D Genomic DNA by ligation，SQK-LSK108)中的接头连接到DNA上，并用AMPure XP磁珠回收DNA文库，取1 μL文库加入微量分光光度计测量DNA含量并保证430 ng以上的DNA用于测序。DNA测序芯片(Flow Cells R.9.4.1)放入MinION测序仪并连接电脑，对机器与芯片进行质检并保证芯片有800以上的可用纳米孔，从芯片priming port孔取出20～30 μL缓冲液以去除气泡，从priming port加入800 μL测序缓冲液并静置5 min。打开sample port孔，再次从priming port加入200 μL测序缓冲液，DNA文库与连接测序试剂盒中的测序珠(LLB)与缓冲液(RBF)混合，一滴一滴加入到sample port孔，关闭sample port与priming port。

1.3 纳米孔测序与分析

MinION测序仪运行48 h，合并获得fastq文件，测序原始数据储存在国家基因库生命大数据可信计算平台(项目编号：CNP0001421，测序编号：CNR0339720)。从公共核酸序列数据库NCBI下载各微孢子、各核多角体病毒、白僵菌、柞蚕肠球菌基因组，作为病原体序列数据库，利用minimap2(v2.17)把测序序列比对到病原体数据库中，以检测测序结果。

2 结果与分析

通过MinION测序仪获得2 116 314条DNA序列约1.87 G个碱基，最长53 282 bp，中位数563，均值884，序列长度大多超过300 bp且集中在 300～1 500 bp长度(图1)。其中，4 476条序列(占总序列2.1‰)被minimap2比对到病原数据库(图2)，且与比对到蓖麻蚕基因组类似，序列长度与比对碱基数量的散点图集中在一片V字区域，并没有线性关系。比对长度超过800 pb的序列中157条序列比对到家蚕微粒子Nosemabombycis基因组，139条序列比对到柞蚕肠球菌Enterococcuspernyi基因组(部分比对结果见表1)，比对长度超过300 bp的序列分别有206和313条序列比对到家蚕微粒子和柞蚕肠球菌基因组(图3)，这说明样品组织已经感染两种病原体。

图1 MinION测序序列长度分布图Fig.1 Distribution of the sequence lengths obtained by MinION

图2 序列比对结果散点图Fig.2 Scatter plot of mapping result注：A图，序列与蓖麻蚕基因组比对结果；B图，序列与病原数据库比对结果。Note：A, mapping results to genome; B, mapping results to pathogen database.

表1 部分序列比对结果

图3 比对到病原基因组且比对长度超过300 bp的序列长度分布小提琴图Fig.3 Violin plot of the sequence length mapped to pathology genomes with more than 300 pb mapping length 注：小提琴图宽度代表序列的数量。Note：Widths of violin plot represent the sequence amount.

3 结论与讨论

昆虫组织具有高蛋白质、高脂肪的特性，并且在被病原体感染后，坏死组织的DNA被降解，然而高通量测序对DNA提取的质量有较高的要求并且起始建库的DNA须达到足够数量，因此昆虫DNA的提取质量决定了最终测序结果的优劣。本研究采用提高裂解液与增加萃取次数的方式提高DNA的提取纯度与数量，为昆虫构建高通量测序文库提供参考。

单分子纳米孔测序技术具有高通量、超长读长、可以直接检测碱基甲基化修饰、无需PCR扩增和体积较小便于携带等优势，可应用于动植物和微生物基因组测序、宏基因组测序、RNA直接测序、微生物检测、DNA与RNA甲基化检测、mRNA的polyA长度定量等研究(曹影等, 2020。然而，单分子纳米孔测序的结果具有较高的错误率，是阻碍其应用的关键。目前MinION测序仪的单碱基准确率约85%，修正后的一致性序列的准确率可达97%～99%，因此对单分子纳米孔测序的分析具有一定的挑战。在DNA文库构建时，本研究通过DNA低速离心打断管以获取更长的DNA片段以构建测序文库，有利于增加序列比对的长度以增加可信度。值得注意的是，minimap2的比对长度并未与序列长度成线性关系，可能与minimap2的算法有关，因此本研究选取的置信区间为最低300 bp的比对长度，即比对长度超过300 bp为可信比对结果。同时，比对数据库中病原物基因组序列的丰富度与病原物种类的选择，会对鉴定结果起关键作用并影响最终鉴定结果。因此，在选择病原物种核酸序列时，应尽可能涵盖所有蚕病病原的基因组序列，降低比对错误与假阳性。本实验选择真菌性病害病原、细菌性病害、微粒子基因组以及所有杆状病毒基因组序列，尽可能构建全面的病原序列数据库以降低鉴定的误差，并且通过过滤序列本身长度短且比对长度较短的序列，以增加比对结果可靠性。

本研究通过MinION测序仪对蓖麻蚕病蚕基因组进行测序，与病原基因组序列库进行比对，无需PCR扩增步骤，降低了假阳性。利用MinION等高通量测序手段对病蚕、蚕具或蚕室进行检测不仅可以一次性准确的鉴定蚕病，也摒弃了PCR方法可能具备的假阳性现象，而且其不需要模板设计引物，甚至可以鉴定新病原等的特性，可以与PCR鉴定方法形成互补，对蚕病的全面监测提供保障。