王雪婧,尹 玲,寇卜心,柴梦音,陈德喜,刘晓霓*,汪晓军*

(1.首都医科大学附属北京佑安医院中西医结合中心,北京 100069;2.首都医科大学附属北京佑安医院北京市肝病研究所,北京 100069)

抗肿瘤药物的研发,从体外筛选到产品开发,需要经过体外药物活性的筛选、体内动物异种移植实验分析和人体临床药效研究三个方面,其中药物体内疗效的验证更是研发过程的关键,需要在一种或多种肿瘤动物模型中展示,耗时长且耗材多。 因此选用一种简单快速、准确可行的肿瘤模型进行初步体内疗效的评估是非常必要的[1]。 中空纤维测定法是美国国家癌症研究所(NCI)于1995 年建立的体内高通量筛选系统,已成为NCI 中常规的抗癌药物筛选方法之一,使大规模筛选抗肿瘤药物成为现实[2]。 近年来,随着中空纤维测定法的广泛应用,在最初基础上有了新的应用进展,本文系统叙述了中空纤维测定法的优势特点和最新应用进展。

1 中空纤维测定法概述

1.1 中空纤维测定法的简介

中空纤维测定法是由Hollingshead 等[2]开发的一种药物筛选方法,是Hollingshead 于1995 年在微囊法和中空纤维细胞培养系统的基础上建立起来的体内高通量抗肿瘤药物筛选模型[3-4]。 其操作方法是在聚偏氟乙烯(PVDF)中空纤维中装入待测的肿瘤细胞,再根据实验目的,将装有不同种类肿瘤细胞的中空纤维管分别植入裸鼠皮下或腹腔,隔日给予受试药物,实验天数结束后取出中空纤维管,用MTT 比色法检测肿瘤细胞的活性,从而得到药物体内抗肿瘤活性的一种实验方法。 如果与对照组相比,净细胞生长减少50%或更多,则认为该药物对特定纤维有影响[5-6]。

中空纤维测定法的关键在于中空纤维管的使用。 在实验中所用的中空纤维管是由改良的聚偏氟乙烯(mPVDF)制作而成,其具有良好的生物相容性和稳定性,可以热封和高温蒸压不会改变其孔径大小,在控制细胞释放、培养、封装和移植研究方面都很理想,代表了分离技术的革命性进展。 其分子截留值(molecularweight cut off, MWCO)为 5.0×105,允许大分子和药物自由通过,同时限制细胞通过。 另外独特的着色特点便于不同细胞系的筛选[6-8]。

1.2 中空纤维测定法的优势特点

数十年来的实验研究表明,中空纤维测定法具有多方面优势,如全真性,高通量性,效率性,节约性,普遍适用性等。 首先,中空纤维可以模拟全真的体内环境。 通过将中空纤维管中培养的肿瘤细胞植入动物体内,使得药物有了体内的生理过程,药物在体内经过转运,并受到体内代谢的影响,是药物体内药效学筛选的一种合理性方法。 需要注意的是,异种移植实验后血管的生成,新生血管对药物传送和敏感性的影响,HFA 并不能完全复制,因此可能存在假阴性结果。 其次,许多种不同的细胞系都适用于中空纤维分析,中空纤维测试法具有普遍适用性。 无论贴壁细胞系还是悬浮培养的细胞系都可以很好的生长,扩大了可筛选的肿瘤细胞系的种类,可以表现为体外细胞毒性实验的体内转移。 但是如果所用细胞系筛选药物需要在传统的异种移植试验进行后续研究,则要求细胞系在免疫缺陷小鼠中是致瘤的。

其中高通量性是中空纤维测定法最突出的优势。 相比较于异种移植的方法,中空纤维测试法可以高通量(一只小鼠多种细胞系)地进行化合物的初步筛选,大大提高了药物体内测试的速度。 之前的研究表明,中空纤维试验与异种移植试验在药物筛选方面具有良好的相关性,中空纤维可以用来克服异种移植的缺点。 移植到免疫缺陷小鼠体内的人类肿瘤在不需要免疫抑制剂的治疗,并且与供者肿瘤细胞有着相似的组织学表现、核型和分子病理学[9-10],相似的治疗敏感性以及相似的器官特异性转移模式[11]。 另外,传统的异种移植试验在动物数量、试验所需化合物、试验完成时间和资金投入等方面的成本都很高,难以作为常规模型大规模开展,对于药物研发期间大规模的体内药效学筛选具有很大的限制性。 而HFA 仅需要少量的化合物,在最短的时间(少于两周)内,花费最少的精力得到药效的定量指标,在HFA 筛选中无活性的化合物免去了在异种移植实验再次筛选的过程,加快了药物研发进程。 此外,使用体内HFA 有助于减少实验动物使用的数量,符合实验动物替换、改善、优化(3R)的原则[12-14]。 综上言之,中空纤维测定法的高通量性以及中空纤维试验与异种移植实验的高相关性,构建起了体外筛选和异种移植实验之间的桥梁,使用体外筛选具有活性的化合物可以使用中空纤维试验优先用于体内分析,是其应用价值的主要体现。

2 中空纤维测定法近十年的最新应用

肿瘤作为全球的一种常见疾病,其发病率和致死率高,抗肿瘤药物的研发始终是各国具有挑战性的难题。 过去大量的研究结果表明,HFA 是一种快速研究抗肿瘤药物药效学(例如,Pervilleines B and C[15], Paclitaxel and Pacliex[16], C1311 andSJG -13[13], ASI-145[17], YSL[18], TAS-102[19])和机制(例如,PCNA and Rb[20], p16[21], NF-κB[22])的有效方法。 在目前抗肿瘤药物的研发过程中,HFA 已应用于抗肿瘤天然药物的评价、抗肿瘤化合物药效学评价以及基于基因组学、蛋白质组学的药物分子机制研究等方面。 此外,利用HFA 进行新药体内评估,并获得体内药效定量指标,有力推动了抗肿瘤新药的研发进程。 以下总结了最近十年来中空纤维测定法在天然药物及合成化合物中的药效和机制评价应用。

2.1 中空纤维测定法在中药等天然抗肿瘤药物中的应用

近年来研究表明,利用HFA 可快速分析中药有效提取物,由于天然药物具有多靶点、多成分协同,代谢复杂等特点,因而需要在一个全真的体内环境展示体内药效。 中空纤维模型的出现,将中药提取物分析与体内药效实验有机结合起来[23-24],从中药中发掘出最有效的抗肿瘤成分,同时可以针对机制做进一步的研究。

Adonis amurensis (AAM)是一种常见于东亚的植物,可以调节细胞生长和新生血管形成, Park等[25]利用 HFA 评价了 AAM 提取物对肿瘤细胞(SK-Hep1 和A549)生长的抑制作用,并探讨其作用机制,结果显示小鼠在25、50 和100 mg/kg AAM 的作用下,SK-HEP-1 细胞的活力分别显著降低至65.9%、60.1 和59.2%,A549 细胞的活力显著降低至81.8%、73.8%和71.7%,表明AAM 提取物具有较强的抗肿瘤活性。 另外研究AAM 激活自噬过程诱导肿瘤细胞死亡,用AAM 提取物治疗癌细胞显著增加了自噬体的形成,并参与了 AKT、ERK 和MAPK 等多种信号组分的激活。 此外,分离出一种活性成分,多苷。 提示中空纤维试验对于中药提取物的体内抗肿瘤活性检测和后续机制的研究是有意义的。 瑞香狼毒(Stellera chamaejasme L)是一种中药, Liu 等[26]的研究结果表明其提取物(ESC,ESC-1 和ESC-2,后两者均从ESC 中分离)对4 种不同肿瘤细胞(NCI-H157,NCI-H460,BEL-7402 和SKHEP-1)均具有体外细胞毒性和促凋亡作用,其中ESC-2 具有最强的抑制作用和最宽的敏感细胞谱。采用HFA 进一步观察瑞香狼毒提取物在体内的抑制和促凋亡作用,结果与体外实验结果一致,根据作用强度、剂量和抗肿瘤谱,ESCs 的抗肿瘤作用顺序为:ESC-2＞ESC＞ESC-1,ESC、ESC-2 能显著提高NCI-H460 细胞凋亡率和 caspase 3、8 酶活性。 ESC和 ESC-2 对 NCI-H460 细胞 Fas、Fas-L 蛋白表达无明显影响,但TNF-α/TNF-R1 蛋白表达有明显变化,结果表明ESC-2 具有与ESC 相似的体内抗肿瘤作用,进一步证实ESC-2 可能是ESC 的主要抗肿瘤活性部位,提示中空纤维试验在天然抗肿瘤药物有效提取物分析方面具有重要的应用价值。 此外,邓晶晶等[27]应用中空纤维测定法评价了藤甲酰苷(gareinia glycosides, GG)对八种人癌细胞的体内抑制作用,结果与异位移植瘤实验一致,张佳佳等[28]采用HFA 研究证实了细薄星芒海绵总萜烯(STS)对多种肿瘤细胞株的体内生长抑制作用,验证了HFA 的可靠性。

2.2 中空纤维测定法在评价化合物体内抗肿瘤活性中的应用

近些年来,大量研究将HFA 应用于化合物体内抗癌活性验证中,推动了具有抗癌活性新化合物的发现。 Fryknäs 等[29]鉴定了一种新的微管蛋白活性剂VLX40。 在小鼠皮下植入髓系U-937 细胞的中空纤维培养物中研究了VLX40 的体内活性,支持了体外研究成果,中空纤维是一种非常有抵抗力的体内肿瘤模型,需要药物渗透到皮下植入的纤维中,因此与其他体内模型相比,体内肿瘤活动的假阳性率较低,有助于新药的体内评估。 此外,Chen 等[30]研究评价了B-2(一种喹唑啉类药物)对非小细胞肺癌(NSCLC)A549 细胞体外和体内存活和生长的选择性作用。 中空纤维试验显示B-2 对A549 细胞的生长和存活有选择性作用, 且呈剂量依赖性。Bachmann 等[31]使用HFA 研究描述了天然产物衍生的syrbactin 结构类似物TIR-199 以剂量依赖的方式抑制蛋白酶体,并诱导多发性骨髓瘤和神经母细胞瘤细胞以及NCI-60 细胞板中的其他癌症类型的肿瘤细胞死亡。 提示采用中空纤维法可以获得体内药物疗效的定量指标。 Behera 等[32]利用HFA 分析证实了Abrus precatorius 凝集素衍生肽10 kDA GP 对宫颈癌细胞(HeLa 细胞)的抗癌作用。 Lee等[33]通过中空纤维试验作为半体内试验,使用卵巢癌OVCAR5、结肠癌SW620、中枢神经系统U251 和黑色素瘤UACC62 四种不同的细胞系,分析了发现转谷氨酰胺酶2(TGase 2)抑制剂GK13 可能对多种肿瘤细胞具有抗癌作用。 Núñez 等[34]利用中空纤维试验验证了新的米特拉霉素衍生物demycarosyl-3D-β-D-digitoxosylmithramycin SK 可能是一种有前途的抗肿瘤药物。 Abonia 等[35]使用中空纤维试验证实新型喹啉-2-酮查尔酮类化合物27 在50 株人肿瘤细胞株表现出最显著的活性,提示化合物27 可作为开发新型抗癌药物的先导化合物。 Jourdan等[36]利用NCI 中空纤维实验讨论了2-取代雌二醇-3,17-O,O-双氨基磺酸酯(e2-双氨基甲酸酯)类似物的合成及其抗增殖活性,显示合成物49 和55 表现出显著的抑制活性。 Eriksson 等[37]采用中空纤维小鼠实验验证了新的低分子量激酶抑制剂AKN-032 的体内活性,并表明该药物具有良好的毒性。Pearce 等[38]利用中空纤维分析从真菌中发现新的抗癌药物。 Gullbo 等[39]在HFA 中验证了新化合物VLX50 可以显著抑制卵巢PCPTC(原代培养的肿瘤细胞)的体内生长。 综上,通过HFA 的广泛应用可以看出,HFA 因其实用性、准确性已逐渐发展成为化合物体内抗肿瘤活性检测中的关键步骤,在新药研发中体现出了愈发重要的价值。

2.3 中空纤维测定法在抗肿瘤机制研究中的应用

Liu 等[40]观察环孢素A(CsA)在体内外是否均能显著增强环唑替尼对多个MET 扩增的NSCLC 细胞的抗肿瘤作用。 通过中空纤维试验和异种移植实验结果共同显示环佐替尼可激活Ras 2(KSR2)信号的钙调磷酸酶(CaN) 激酶抑制物,从而激活Erk1/2,提高癌细胞的存活率,CsA 能有效阻断CaN-KSR2-Erk1/2 信号传导,促进环唑替尼诱导的细胞凋亡和G2/M 期阻滞。 同样,Erk1/2 的药理学或遗传抑制也增强了环唑替尼的体外生长抑制作用。 证实 CsA 或 Erk1/2 抑制剂 PD98059 通过抑制CaN-Erk1/2 轴增强了环唑替尼的抗癌活性。 Veiga等[41]通过体内/外 HFA 技术,在分子水平上监测DNA 插层剂和烷基化剂对DNA 双链断裂(dsb)诱导的影响,利用该方法评估DNA 插层剂和烷基化剂对人肺癌、结肠癌和乳腺癌细胞系的药效学特性。使用标准药物阿霉素,研究表明γ-H2A.X(dsb 检测的可靠标志物)可以通过免疫印迹和流式细胞术可靠地检测,证明HFA 可用于体内药物/靶点作用机制的分析,同时从3Rs 的角度来看,对减少和改进动物的使用也有重大影响。 Oza 等[42]在特定的中空纤维药代动力学模型中描述了一类Chk1(一种Ser/Thr 蛋白激酶)抑制剂,三唑喹啉酮/三唑酮(TZs)的合成和评价。 用拓扑替康(50 nm)处理中空纤维PD 模型中的HCT116 细胞,然后用TZ 类抑制剂16e处理,将HFA 应用于化合物结构-活性关系分析,该模型中TZs 与化疗药物和放疗联合应用的活性证实了该系列Chk1 抑制剂的有效性,另外结果显示16e被证明以剂量依赖的方式消除拓扑替康诱导的细胞周期阻滞。 近年的这些研究显示出了HFA 在机制研究上的可行性价值。

3 中空纤维测定法的改良优化

3.1 MiniPDX 模型

人源肿瘤异种移植模型(PDXs)是一种功能诊断的强大模型,对抗癌药物反应具有高预测能力,但是受移植失败、建立和扩展PDX 模型及随后进行药物疗效测试耗时过长等因素的限制,阻碍了其在临床上选择正确、可行治疗方案的快速决策,因此设计一种快速准确PDX 扩展模型是十分必要的。

在过去的研究中, 原代培养的肿瘤细胞(PCPTC)已经被证明可应用于预测诊断特异性活性和个体患者对抗癌药物的反应。 Gullbo 等[39]首次将其应用于高通量筛选的新药鉴定中,利用中空纤维模型证实了原代培养的人卵巢癌细胞在小鼠体内具有显著活性,表明PCPTC 用于肿瘤药物的高通量筛选是可行的。 目前,Zhang 等[43]对中空纤维肿瘤模型作出改良,将患者来源的肿瘤细胞注入中空纤维胶囊中,随后对其细胞活性、形态和药代动力学进行系统评价。 开发了一种先进的PDX 模型,命名为MiniPDX。 以PDX 模型为参考,实验检测了MiniPDX 的性能(敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值)。 结果显示迷你PDX 胶囊中肿瘤细胞的形态和组织病理学特征与PDX 模型和原发肿瘤细胞一致,PDX 肿瘤移植物实验的药物反应与相应的MiniPDX 实验的药物反应有很好的相关性,其中MiniPDX 阳性预测值为92%,阴性预测值为81%,敏感性为80%,特异性为93%。 这些研究数据表明通过将MiniPDX 法应用于临床肿瘤标本,显示了其广泛的临床应用潜力。 在 Liu 等[40]的研究中,从MET 扩增肺癌患者中建立了3 株原代细胞株并将其注入纤维,在中空纤维模型中证实环孢素a(CsA)可促进环唑替尼(crizotinib)的抗肿瘤活性。 研究验证了MiniPDX 试验是一种先进的个性化癌症治疗工具,可用于快速检测药物疗效,增强其在个性化癌症治疗中的价值。

3.2 胃癌细胞株和肝细胞肝癌细胞株的HFA优化

中空纤维试验为体内抗癌药物筛选提供了一种早期的方法,这些检测方法已经针对肺癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌和脑癌进行了优化,但并非针对胃和肝的癌症。 因此, Park 等[44]研究了优化人胃癌和肝癌细胞系的中空纤维检测方法。 将中空纤维胃癌细胞株(SNU-16、SNU-484、SNU-668)和肝细胞癌细胞株(HepG2、SK-Hep-1、Hep3B)分别经皮下和腹腔移植到小鼠体内,然后用标准抗癌药物紫杉醇治疗。 比较不同细胞系紫杉醇中空纤维活性和异种移植活性。 在优化的条件下,在SNU-16 细胞中对新型化合物EW7197 和黄腐霉素进行检测,发现中空纤维的活性与各化合物的异种移植物活性有很好的相关性[45]。

3.3 其他

体内临床前分析需要筛选潜在的靶向肿瘤血管的药物, Cooper 等[46]采用了中空纤维细胞分析技术,对NCI 试验进行了修改,使其更适合于研究抗血管生成和其他血管靶向性策略,方法是仅皮下移植,并减少移植的纤维的大小和数量,以尽量减少纤维周围因纤维封条损伤而产生的灌注周围的组织。 并且将纤维周围新生血管的免疫组化分析作为量化药物效应的终点,描述了一种基于中空纤维的定量检测肿瘤新生血管的方法。 戚欣等[47]比较了中空纤维测定法在免疫缺陷小鼠和免疫正常小鼠体内的应用,结果显示KM 小鼠可以替代裸鼠用于中空纤维测定法对化合物的体内抗肿瘤活性进行初步筛选,昆明小鼠的使用可以降低实验成本,进一步促进中空纤维法在我国的推广应用。

4 小结与展望

抗肿瘤药物的发现与筛选需要一种快速体内模型进行体内药效学的评估,中空纤维测定法的出现,因其高通量性有力推动了抗肿瘤药物的研发进程。 近些年来,大量研究将中空纤维测试法应用于新药的体内评估上,推动了新化合物和天然抗肿瘤药物等的研发。 此外,HFA 不仅应用于抗肿瘤药物研究,更是一种特异的,高效的体内活性评估模型。在其他细胞的药物活性研究[48]以及抗病原体(细菌、病毒等)药物[49]的体内筛选方面也有着重要应用价值,还可以应用于血管生长分析。

然而在体内活性筛选方面,因其尚不能完全模拟肿瘤与宿主细胞之间复杂的反应,HFA 在目前无法完全取代传统移植瘤模型。 在过去的研究中,采用中空纤维模型与异种移植肿瘤模型相结合,被证明是一种准确可行的药效学评估方案。 HFA 的改良优化使其适用性更加广泛,最新miniPDX 模型的出现推动了个体化肿瘤治疗的研究进展。 利用患者来源的肿瘤细胞预测癌症药物对个体患者的临床活性,miniPDX 模型在癌症药物临床前开发以及个体化癌症治疗方面有着重要应用价值,在未来,可将miniPDX 模型用于药物作用机制研究上。 综上所述,中空纤维肿瘤模型因其简便性、优越性、实用性在肿瘤药物研发等方面展现出了重要的应用价值;更加值得注意的是,其在个体化治疗上也显示出了巨大的应用潜力。