刘 宸,李 超,方梦蝶,任 娟,徐 昊,王孝举,张衍梅

(浙江省医学科学院分子医学中心,杭州 310012)

印记位点调节物兄弟因子(the brother of the regular of imprinted sites,BORIS),是调控细胞核三维空间结构的因子CTCF(CCCTC binding factor)的唯一同源因子。BORIS在生理状态下仅在健康人体睾丸中正常表达,但在多种癌症中发现BORIS在除睾丸外的癌组织中异常表达[1],且BORIS高表达的癌症患者的生存期相对较短,因此,BORIS是潜在的肿瘤治疗靶标[2-3]。BORIS在男性的睾丸中参与精子发生[4],而女性体内几乎检测不到BORIS。虽然BORIS敲除小鼠未发现生命周期和生存状态改变,在雌性表型和繁育能力均正常的情况下,BORIS缺失导致雄性不育的问题仍将严重破坏种群繁衍。本文综述了BORIS在正常睾丸中的表达,BORIS基因敲除小鼠和转基因鼠的胚胎发育研究,BORIS在睾丸中功能的研究,对精子发生的调控作用,以及细胞质定位BORIS的功能研究进展和影响BORIS通路的相关药物。我们希望在理解正常组织中在生理状态下BORIS的表达和功能的基础上更深入地解析和挖掘BORIS在癌细胞中的作用机制,以及在此基础上筛选提高男性生育能力且无诱发癌症风险的生物活性药物。

1 BORIS在健康睾丸中特异性高表达

BORIS在健康雄性小鼠睾丸中高表达,但并非在胚胎睾丸发育初始就表达,为了验证其表达时序,Jelinic等[5]利用免疫组化实验检测了小鼠胚胎中BORIS的表达时序。研究发现在胚胎发育13.5 dpc(交配后天数)时未检测到BORIS,但在14.5 dpc胚胎的有丝分裂停滞的生殖细胞中观察到BORIS蛋白表达,17.5 dpc时位于生精小管中心的生殖细胞有BORIS的表达。而小鼠成熟精子中未发现有BORIS[6]。与在机体内普遍表达的CTCF不同,BORIS在生理条件下仅在雄性睾丸中高表达。Loukinov等[7]于2002年发现CTCF和BORIS在睾丸中的分布存在是互斥的。精原细胞经过初级精母细胞,次级精母细胞,最后发育为精子细胞。Sleutels等[6]以正常成年小鼠睾丸为实验材料,他们分离出了完整的曲细精管,发现CTCF在曲细精管精子发生的任何时期表达,而BORIS仅在晚期精母细胞和线性前期的精原细胞中有表达,且在精母细胞中BORIS在细胞质中的含量比细胞核更加丰富。但也有报道阐述在圆形精子中检测到了BORIS的mRNA的表达[8]。上述各项研究均指示BORIS在生精小管中的精母精原细胞区表达。

在健康小鼠中BORIS在精子发生阶段才开始出现,并可能进一步影响精原和精母细胞的发育,但随着精子的成熟BORIS的表达消失。因此BORIS的表达时序与精子发生时序高度一致,这提示BORIS的表达和功能在健康雄性小鼠中有调控精子发生的专一性。

2 BORIS的正常表达维持胚胎发育

BORIS在胚胎发育中的具有重要作用。Sleutels等[6]于2012年构建了BORIS基因敲除小鼠,繁殖出杂合子BORISdel/+和纯合子BORISdel/del小鼠。基因敲除后的小鼠无任何表型及行为异常。实验证明,无论纯合子还是杂合子均对雌性小鼠无生育影响。而在雄性小鼠中,杂合子小鼠正常发育,小鼠依然有预期生育率。而纯合子小鼠的生育率明显降低。称重90日龄的BORIS基因敲除小鼠的睾丸的重量,纯合子的睾丸平均重量显著低于杂合子小鼠的睾丸,且精子含量显著降低,仅为杂合子的15%[6]。上述研究表明,BORIS基因缺失影响雄性动物的生育能力,但不影响雌性动物的生长发育、生殖及哺育后代的能力。

BORIS的异常表达影响胚胎的正常生长发育。Sati等[9]构建了BORIS转基因小鼠,并对新生转基因小鼠与野生型小鼠进行BORIS的表达对比。以qRT-PCR的方式检测肝、肺、肾、脑、眼和皮肤组织,野生型小鼠中未发现BORIS表达,而转基因小鼠的上述器官中均有不同程度的表达,以肺和皮肤组织表达量最高。研究表明BORIS转基因小鼠出现了生长迟缓、眼睛畸形、多器官病变、血管缺陷和新生儿死亡等现象。该研究证明在胚胎早期发育时期出现BORIS的表达将显著影响机体的生长发育。

综合BORIS在健康小鼠睾丸发育时序中的表达以及BORIS敲除、转基因对小鼠的影响,BORIS可能仅在健康哺乳动物睾丸发育过程中特异表达,并专一调控精子发生。BORIS的缺失虽然不影响动物个体的生命周期和生存状态,但极大降低雄性动物的生育能力,从而影响其种群的繁殖能力。

3 睾丸中BORIS通过竞争抑制调控精子发生

BORIS与其旁系同源蛋白CTCF的位于中部的氨基酸序列为锌指结构区,11个高度同源的锌指区域使得二者识别相同的DNA簇。但BORIS和CTCF的氨基和羧基端差异较大,差异区域占据各自蛋白质氨基酸序列全长近三分之二的区域[7]。BORIS的氨基和羧基端可能与不同配体相互作用竞争CTCF的结合位点[10]。研究表明BORIS与CTCF不同,BORIS识别DNA时并不依赖DNA甲基化的程度[11]。对基因的表达调控研究发现,BORIS激活基因表达,而CTCF抑制基因表达[12]。这些结果表明,CTCF通常为抑制因子抑制基因转录,而BORIS是激活因子促进基因转录[12]。

在分离的野生型小鼠睾丸细胞中利用BORIS和CTCF的抗体进行染色质免疫共沉淀(ChIP),结果显示BORIS与Stra8和Prss50的启动子优先结合,而CTCF与Vps18优先结合,该结果表明BORIS在睾丸中拥有和CTCF不同的功能[6]。Stra8在B精原细胞发育至线性前期精母细胞瞬时表达,Stra8的瞬时表达对于视黄酸诱导的减数分裂必需[13-14]。免疫组化结果显示BORIS的表达时序类似Stra8,胚胎干细胞中BORIS的过表达研究显示GFP-BORIS在特定位点结合且诱导睾丸特异性基因表达[6]。ChIP研究显示GFP-BORIS与Gal3st1,Stra8和Prss50的启动子结合,调控并诱导上述基因的表达[6],其中Gal3st1对精子发生必需[8]。上述研究均表明睾丸中表达的BORIS与精子发生密切相关。

4 BORIS与睾丸特异性转录调节因子共同调控睾丸发育

BORIS缺失小鼠会因睾丸变小、配子产生延迟而导致生育能力降低,研究发现受BORIS调控的Stra8和Prss50等基因调控下游基因的表达影响精子发生[6,15],因此BORIS可能通过睾丸特异性转录因子级联影响睾丸的发育。Pugacheva等[16]通过ChIP对小鼠睾丸中BORIS和CTCF的结合位点进行分析,发现存在2类CTCF家族因子结合位点:1xCTSes(单一motif)和2xCTSes(重复motif)。其中CTCF结合1xCTSes,而BORIS结合2xCTSes或BORIS和CTCF共同结合2xCTSes。相比于CTCF的结合位点1xCTSes,BORIS的结合位点2xCTSes可富集更多的转录相关因子RNAP II,H3K27ac和H3K4me3[16],表明BORIS更易富集转录因子、参与转录调控。

研究发现睾丸特异性转录调节因子(testisspecific transcriptional regulators,TSTRs)富集在BORIS在基因组上的结合位点,调控睾丸发育。通过ChIP分析数个TSTR(A-myb、Brd4、Dmrt1、Dmrt6、Taf7l、Rfx2、Trim33)与1xCTSes或2xCTSes两类结合位点的相互作用,发现TSTR于13.4%的BORIS和CTCF共同的结合位点富集,于44.2%的BORIS单独结合位点富集,而CTCF单独结合位点几乎没有TSTR的富集[16]。在已确定的位点中,只有那些与TSTR相结合的BORIS结合位点才与成熟精子中鱼精蛋白的组蛋白保留区紧密相连[17]。精子中TSTR相关的BORIS结合位点,可通过促进精子中的高水平转录以及组织精子染色质来促进组蛋白在精子中的保留。组蛋白与精子分化为单倍体密切相关[18],由此可知,TSTR与BORIS在基因组上结合位点的相互作用对精子发生有重要影响。

5 细胞质定位BORIS的功能及机制

在精子发生过程中,精原细胞的干细胞性特征和精母细胞的正常生长发育是非常关键的。已有研究表明BORIS和细胞凋亡、细胞周期、干细胞调节相关[1]。Zhang等[19]研究发现细胞质定位的BORIS有明确的抑制细胞凋亡的功能。通过删除中部锌指结构域,构建了细胞质定位的BORIS(BORIS-ZFdel),发现BORIS-ZFdel阻止细胞色素C从线粒体释放到细胞质,同时caspase3/7活性减弱,确证了细胞质定位的BORIS有抑制细胞凋亡的功能。

此外,BORIS调控细胞有丝分裂的细胞周期[20]。和其他细胞周期调节因子相似,BORIS的过量表达影响了细胞周期的正常进行[21],BORIS调控细胞周期标志因子PCNA and Cyclin A的表达,BORIS的过度表达引起细胞在S期的积累、细胞增大和多倍体细胞的出现,导致有丝分裂失败。BORIS需要被进一步降解以利于细胞周期的顺利进行。去甲基化作用显著提高BORIS的表达量,因此BORIS在癌症中被激活[22],去甲基酶脂肪团和肥胖相关蛋白(fat mass and obesity-associated protein,FTO)基因敲除的小鼠出现小鼠精原细胞中染色体不稳定,以及将细胞阻滞于G2/M期[23],睾丸中由于去甲基化程度影响的BORIS的表达水平可能调控精母精原细胞有丝分裂的细胞周期,进而影响精子发生[23-24]。

BORIS亦参与调节干细胞。已有研究表明BORIS在癌症干细胞中表达,与特定的干细胞标记呈正相关(如hTERT端粒酶基因),因此被认定为是干细胞标记物的正向调节剂,并在维持干细胞中发挥作用[1]。BORIS沉默后,干细胞标记因子如ALDH1、NANOG、OCT4、SOX2和ABCG2普遍下调,BORIS可能通过诱导hTERT端粒酶表达,使干细胞获得自我更新和永生的能力[25]。

6 基于BORIS为靶点的药物研究

Fang等[26]利用BORIS表达干扰的microarray表达谱比对CMap数据库,从1309种药物处理6种细胞获得的microarray表达谱中比对获得了与BORIS表达干扰处理相似的药物苍术苷。SEMA3A、X RCC4和PPLL6基因在苍术苷处理和BORIS表达干扰处理下表达均升高。苍术苷是苍耳子提取物,研究表明苍术苷作用于线粒体[27],导致线粒体通透性增强,提示BORIS可能作用在线粒体相关信号通路上。有研究证明,苍术苷有促进大鼠精子早期凋亡现象,且在苍术苷作用下,精子线粒体会出现融合、外膜破损、通透性增加和基质丢失等情况[27],BORIS敲除小鼠中也发现精原精母细胞大量凋亡的现象。BORIS出现在精子发生早期,在细胞中起到抑制凋亡和促进增殖的作用。在早期精子中,苍术苷可能抑制BORIS的功能,导致大鼠精子出现了早期凋亡。

7 结语和展望

以往研究发现位于Y染色体的Usp9y,X染色体的Usp26,及常染色体的Sox30等都有调控精子发生的作用[28-30],但特殊的是BORIS在生理状况下仅在人体睾丸中表达,且是调控精子发生的关键因子之一,但目前缺乏与男性不育症的相关研究。BORIS基因敲除仅影响成年雄性的生育能力,但对幼龄和雌性个体无任何影响(包括行为、表型、生存周期和繁育能力),BORIS失调将严重影响男性的生育能力进而影响种群的繁育[6]。BORIS参与精子发生并对男性生育起重要作用,对于少精或精子发育异常的男性患者可考虑应用激活BORIS的治疗方法。此外,BORIS在除睾丸外的其他器官中表达会导致胚胎发育异常和致死,而BORIS也被发现与多种肿瘤发生、耐药和癌症患者预后相关[31-32]。因此BORIS也是潜在的抗肿瘤作用靶点。由于目前世界范围内并未筛选出直接靶向BORIS的抗肿瘤生物活性抑制剂,考虑到BORIS在精子发生中的重要作用,靶向BORIS的肿瘤治疗药物的筛选应建立以精母精原细胞为对照的并行的肿瘤细胞药物筛选模型,以甄别有效抑制肿瘤且保护男性生育能力的BORIS靶向药物。综上所述,BORIS与雄性哺乳动物的精子发生密切相关,对BORIS在睾丸中的功能研究将解析其作用机制,为靶向BORIS的药物筛选,建立保护BORIS活性的方法奠定基础。