王雅轩，朱晓雁，苏建荣

CRISPR/Cas系统存在于细菌和古细菌中，它们的主要作用是保护生物体免受如质粒和噬菌体等外源DNA的入侵。1987年, Ishino等[1]于E.coli编码碱性磷酸酶的iap基因附近首次发现了一种特殊的重复序列。由于这个新颖的重复DNA序列家族的特征是具有21～37 bp的直接重复序列，并由大小相似的非重复序列分隔，故Jansen等[2]于2002年将其命名为簇状规律间隔的短回文序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)，即CRISPR。2005年，Bolotin等[3]发现，CRISPR表观出稳定性和广泛存在性可能是由于它们具有抵抗外源DNA入侵的保护作用。2007年,研究表明原核生物内可能存在一种基于核酸的免疫系统，其特异性由CRISPR间隔区决定，而抗性由Cas酶决定，并说明CRISPR是一种可以保护嗜热链球菌免受外来噬菌体侵袭的适应性免疫系统[4]。2011年，通过对化脓性链球菌进行分析发现了一种反式编码小RNA，即tracrRNA。tracrRNA通过广泛保守的内源性RNase III和CRISPR相关的Csn1蛋白的活性来指导crRNA的成熟。所有这些成分对于保护该菌免受原噬菌体衍生的DNA侵袭至关重要[5]。2012年，研究人员揭示了一个通过反式激活tracrRNA与配对的成熟crRNA形成的双RNA进行位点特异性DNA切割的核酸内切酶家族，并指出了该家族进行基因编辑的潜力[6]。近几年，Doudna研究组和张锋研究团队等相继将CRISPR/Cas系统应用于核酸检测领域，并且通过将重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)等等温扩增反应与其结合，实现了单个核酸分子的检测。本文将主要对CRISPR/Cas中的Cas9、Cas12、Cas13以及Cas14在病原体检测方面的最新进展进行阐述。

1 Cas9在病原体检测中的应用

Cas9是Ⅱ型 CRISPR / Cas 系统中被广泛应用的标志性核酸酶,在由tracrRNA 与成熟 crRNA 形成的tracrRNA / crRNA的引导下,特异性切割靶标双链 DNA(double strands DNA, dsDNA)。……