杜志花，闻 美，王永吉，张粉果

（山西师范大学生命科学学院，山西 临汾 041000）

我国的石灰岩矿资源十分丰富，相关统计表明，出露地表的石灰岩总面积多达130 万km2，而埋藏于地下的则更为广泛。近几年来，石灰岩被广泛应用于建筑、化工和农业等方面，市场需求量逐年增加[1]，石灰岩生态系统受到极大破坏。石灰岩土壤含有较高的钙镁元素，其土层浅薄，盐碱性高，持水能力弱，受到破坏后其植被恢复和生态修复难度大。当前对石灰岩地区的研究主要集中于石灰岩地区动植物、细菌、真菌等物种的组成与多样性分布以及该地区特有植物的适应生境分布[2-3]，而钙对植物生长影响的研究则主要集中于钙离子对其他因子胁迫的缓解作用[4-6]，有关石灰岩地区利用植物生态恢复的研究则相对较少。因此，开展植物在石灰岩地区的生态适应性研究，对于石灰岩地区生态恢复尤为重要。

多年生黑麦草(Lolium perenne)是禾本科(Poaceae)黑麦草属(Lolium)草本植物，丛生，根系发达，分蘖多，易种植，耐盐碱，能增加土壤有机质，改善土壤结构，防止水土流失，是优质牧草和绿肥作物[7]。开展黑麦草相关研究，不仅能为畜牧业提供足够的牧草，而且可以改善和恢复我国日益严重的石灰岩地区生态环境。温度是植物生长过程中必不可少的条件，对种子萌发有着非常大的影响，温度过高或过低均会对种子萌发起到一定的遏制作用[8]。目前，国内外对黑麦草的研究主要集中于重金属污染胁迫[8-10]、盐胁迫[11-15]、高温胁迫[16]、干旱胁迫[17-18]、冻融[19-21]、各种生长激素刺激等[22]对黑麦草生长发育、生理生化等的影响，以及黑麦草栽培管理、分布分类、种植利用等方面。汪霞等[11]、Marcum 和Pessarakli[13]发现随着盐浓度的增高，黑麦草种子发芽率和活力指数逐渐下降；徐彦红等[23]指出不同钙磷元素比对黑麦草根的抑制作用大于苗，5 mmol·L−1是适宜黑麦草萌发的钙磷浓度比；而有关温度和氯化钙浓度共同对黑麦草种子萌发作用的研究鲜见报道。本研究以多年生黑麦草种子为材料，在适合的光照条件下研究温度和氯化钙对黑麦草种子萌发的影响，寻找适合石灰岩地区黑麦草种子萌发的适宜温度和氯化钙浓度，以期丰富黑麦草适应性方面的研究，为石灰岩土地的改良、利用以及水土保持提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 种子的来源与保存

试供种子材料为禾本科黑麦草属多年生黑麦草种子，品种为卡特，2018 年购买于北京德农种业股份公司。经试验测定，初始含水量约为10%。种子千粒重为1.836 7 g。初始发芽率在90%左右。

1.2 种子萌发试验

种子预处理：挑选籽粒饱满、大小均匀的黑麦草种子，经0.3%的高锰酸钾溶液浸种消毒5 min，去离子水充分洗净，吸水纸吸干种子表面水分，备用。

温度和光照：将黑麦草种子置于直径为6 cm 的一次性无菌培养皿中，内铺双层滤纸，分别在5 ℃/15 ℃、10 ℃/20 ℃、15 ℃/25 ℃、20 ℃/30 ℃的温度范围内以及在光照/黑暗(12 h/12 h)和全黑暗(24 h)的光照条件下进行萌发，光照强度为1 500 lx，培养溶液为纯净水，每组4 个重复，每个重复25 粒种子。温度和光照发芽试验持续17 d，并于每日18: 00 观察记录黑麦草种子发芽数(胚根或胚芽突破种皮1 mm 即视为种子萌发)，且定期补充蒸馏水以保持培养皿的湿润。最后计算种子的发芽率、发芽势、发芽指数，确定黑麦草种子的最适光照条件。

温度和氯化钙：取96 个培养皿，分别用2 mL 的0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%浓度氯化钙溶液润湿滤纸，把黑麦草种子用0.3%的高锰酸钾溶液消毒处理后，每组随机取100 粒，每个培养皿25 粒，均匀平摊在培养皿的滤纸上，使种子间留有一定间距。温度与氯化钙试验在最适光照条件下进行，将培养皿分别放入5 ℃/15 ℃、10 ℃/20 ℃、15 ℃/25 ℃、20 ℃/30 ℃的智能光照培养箱中进行培养，每个温度下设置6 种浓度，在最适光照(12 h光照/12 h 黑暗)条件下催芽，每个处理4 次重复。每日18：00 观察并记录种子发芽数，定期补充相应浓度的氯化钙溶液以保持培养皿内的湿润，连续培养观察17 d。

1.3 测定指标

种子千粒重：随机抽取4 份种子，每份1 000 粒，以精确度为0.000 01 水平的电子天平称重，求平均值。

发芽率(germination rate, GR) = 种 子 发 芽 总 数/供试种子总数 × 100%[6]。

发芽势(germination energy, GE) = 日发芽种子数达到高峰时，发芽种子总数/供试种子总数 × 100%[6](光照试验中发芽势在第4 天达到最高峰，温度与氯化钙试验中发芽势在第5 天达到最高峰)。

1.4 数据分析

采用SPSS 20.0 统计软件进行单因素方差和多因素方差分析，用Duncan′s 法进行显著性差异分析，检验显著性水平设为0.05，利用Origin 2019b 整理数据和绘图。

2 结果与分析

2.1 黑麦草种子萌发的最适光照条件

黑麦 草 种子在最 适 光 照(12 h 光 照/12 h 黑暗)条件下，温度为20 ℃/30 ℃时，光照处理下黑麦草种子的发芽率显著高于黑暗处理下的发芽率(P ＜0.05) (图1)，而其他温度时各处理发芽率无显著差异(P ＞ 0.05)；且光照处理下，黑麦草发芽率在4 个不同的温度梯度下无显著差异(P ＞ 0.05)；相对于光照处理，黑暗处理下的黑麦草发芽率受温度影响大，其中5 ℃/15 ℃时发芽率最高，高达96%，而20℃/30 ℃的发芽率仅为75%，可见光照对黑麦草发芽率有促进作用。

图1 温度和光照对黑麦草发芽率的影响Figure 1 Effects of temperature and light on the germination rate of ryegrass

温度为5 ℃/15 ℃和10 ℃/20 ℃时，黑暗处理较光照处理下的黑麦草发芽势高(图2)，但差异不显著(P ＞ 0.05)。而温度为20 ℃/30 ℃时，光照处理下的发芽势显著高于黑暗处理(P ＜ 0.05)。

温 度 为5 ℃/15 ℃、10 ℃/20 ℃和15 ℃/25 ℃时，黑暗处理与光照处理的黑麦草发芽指数均无显著差异(P ＞ 0.05) (图3)，但在20 ℃/30 ℃时，光照处理下的黑麦草种子的发芽指数显著高于黑暗处理(P ＜ 0.05)，高36.82%。可见，光照能促进黑麦草的发芽指数。

图2 温度和光照对黑麦草发芽势的影响Figure 2 Effects of temperature and light on the germination potential of ryegrass

图3 温度和光照对黑麦草发芽指数的影响Figure 3 Effects of temperature and light on the germination index of ryegrass

综上所述，温度为20 ℃/30 ℃时，光照条件处理下的黑麦草种子的各项萌发指标显著高于黑暗处理(P ＜ 0.05)，因此，正式试验选择在光照条件下研究温度和氯化钙对黑麦草萌发的影响。

2.2 温度和氯化钙对黑麦草种子发芽率的影响

温度和氯化钙及其交互作用对黑麦草种子的发芽率均有显著影响(P ＜ 0.05) (表1)。同一温度下(20 ℃/30 ℃除外)，1.0%氯化钙处理下的黑麦草种子发芽率最高(表2)；温度为10 ℃/20、15 ℃/25、20℃/30 ℃且氯化钙浓度 ＞ 1.0%时，随着氯化钙浓度的增大，黑麦草种子在发芽率逐渐降低。在氯化钙浓度 ≤ 1.5%时，温度对黑麦草种子发芽率无显著影响(P ＞ 0.05) (表2)，氯化钙浓度为2.0%时，黑麦草种子发芽率在15 ℃/25 ℃时达到最大，为78%，5℃/15℃时发芽率最小，为11%；同样，在氯化钙浓度为2.5%和3.0%时，发芽率都是在15 ℃/25 ℃时达到最大，分别是45%和23%，在5 ℃/15℃和20 ℃/30 ℃时最小，分别为15%和3%。由此可知，当氯化钙浓度 ＜ 2.0%时，温度对黑麦草种子发芽率无显著影响(P ＞ 0.05)，但当氯化钙浓度 ≥ 2.0%，温度在15 ℃/25 ℃时可促进黑麦草种子的发芽率，且温度过高或过低都会对黑麦草种子发芽率造成一定的影响。

表1 温度和氯化钙对黑麦草种子发芽指标的影响Table 1 Effect of temperature and calcium chloride on germination index of ryegrass seeds

表2 温度和氯化钙处理对黑麦草种子发芽率的影响Table 2 Effects of temperature and calcium chloride treatment on germination rate of ryegrass seeds%

2.3 温度和氯化钙对黑麦草种子发芽势的影响

温度和氯化钙对黑麦草发芽势有显著影响(P ＜0.05) (表1)。同一温度下，黑麦草发芽势在氯化钙浓度为3.0%最小(表3)；在温度为15 ℃/25 和20 ℃/30℃时，氯化钙浓度从1.0%开始黑麦草发芽势随着氯化钙浓度的增加而呈逐级递减趋势，但在5 ℃/15 ℃时，2.5%氯化钙处理下黑麦草的发芽势显然要比2.0%和3.0%的高，这对温度低且氯化钙浓度高的环境下黑麦草培育有一定的意义。在2.0%的氯化钙浓度下，黑麦草种子的发芽势在5 ℃/15 ℃和10 ℃/20 ℃下具有显著差异(P ＜ 0.05) 。在氯化钙浓度≤1.5%时，不同温度下的发芽势普遍都比较高。氯化钙浓度为2.0%时，温度在5 ℃/15 ℃时会抑制黑麦草的发芽势，适当的增温有利于黑麦草发芽势的上升，在15 ℃/25 ℃时达到最高，可见温度过高或过低都会抑制黑麦草的发芽势。

2.4 温度和氯化钙对黑麦草种子发芽指数的影响

温度和氯化钙对黑麦草发芽指数有显著影响(P ＜ 0.05) (表1)。同一温度下，氯化钙浓度≤ 1.5%时，黑麦草种子发芽指数较高(表4)，其中在20 ℃/30 ℃时，0.5%浓度的氯化钙有助于黑麦草种子发芽指数的升高，随着氯化钙浓度逐渐增大，黑麦草发芽指数越来越低，3.0%的氯化钙最不利于黑麦草的发芽指数。由此可见，在温度为10 ℃/20 ℃和15 ℃/25 ℃时，一定浓度的氯化钙对黑麦草种子萌发具有一定的促进作用，但浓度过高(3.0%)则会大大抑制黑麦草种子发芽指数，不利于种子萌发。同时，同一浓度下，随着温度升高，黑麦草发芽指数呈增加趋势，温度在5 ℃/15 ℃下发芽指数最低，0.5%氯化钙处理下，黑麦草发芽指数在20 ℃/30 ℃时达到最高，2.0%氯化钙处理下，黑麦草发芽指数在15 ℃/25 ℃时高于其他温度。

表3 温度和氯化钙处理对黑麦草种子发芽势的影响Table 3 Effects of temperature and calcium chloride treatment on germination potential of ryegrass seeds%

表4 温度和氯化钙处理对黑麦草种子发芽指数的影响Table 4 Effects of temperature and calcium chloride treatment on germination index of ryegrass seeds

3 讨论

种子是植物生活史中的重要阶段，种子的发芽率、发芽势和发芽指数反映了种子发芽速度、整齐度和幼苗健壮的潜势和生物量[24]。钙是高等植物生长所必需的元素之一，Ca2+作为信号物质，参与植物生长发育以及种子萌发的过程[25-26]。种子萌发过程中，温度也是一个不可缺少的因素，温度过高或过低均会对种子萌发造成较大的影响。本研究结果显示，每个温度下，黑麦草发芽率、发芽势和发芽指数在0.5%和1.0%的氯化钙浓度下均较其他浓度的高(其中1.0%氯化钙处理下的种子萌发得最好)，且受温度影响相对较小；当氯化钙浓度为2.0%、2.5%、3.0%时，黑麦草种子萌发受到了抑制，受温度影响相对较大，其中15 ℃/25 ℃是最适合黑麦草种子萌发的，由此可知，一定低浓度下的氯化钙可促进黑麦草种子的萌发，但高浓度的氯化钙则会抑制黑麦草种子的发芽率，本研究结果与周际海等[27]黑麦草种子萌发和幼苗生长对重金属离子的响应表现为“低促高抑”的结果有相似性。可能原因是低浓度的Ca2+有利于维持细胞质膜的完整性，且Ca2+是偶联胞外刺激和胞内反应的第二信使，对植物生长发育的各个方面有调节作用，能帮助植物抵抗一定的逆境，在Ca2+浓度较低时，Ca2+的作用明显，掩盖了温度对黑麦草的影响，因此各个温度下低浓度氯化钙处理的黑麦草长势都比较好[28]；而当氯化钙浓度较大时，Ca2+过多，水势降低，导致种子幼芽吸水困难，使植物细胞渗透失衡，导致种子萌发过程中生理缺水，影响种子萌发，此时温度对种子的萌发有了较明显的作用，温度的适当升高促进了种子的呼吸，温度过低或过高都会影响种子酶的活性[29]。该研究表明，高浓度的氯化钙处理下，15 ℃/25 ℃是适合黑麦草萌发的最佳温度，该温度范围也符合前人研究结果。贾风勤[16]研究指出，最适合车前(Plantago asiatica)种子萌发的温度为20～30 ℃，刘林等[30]同样指出报春花(Primula malacoides)的最适温度在20 ℃或25 ℃。本研究中，当氯化钙浓度为3.0%时，黑麦草发芽率、发芽势和发芽指数均最低，尤其是发芽指数，推测引发黑麦草种子萌发的氯化钙浓度最大阈值为3.0%。

4 结论

低浓度(≤ 1.5%)氯化钙促进了黑麦草种子萌发，而高浓度(≥ 2.0%)氯化钙抑制了黑麦草种子的发芽率、发芽势和发芽指数，黑麦草种子萌发的氯化钙浓度最大阈值为3.0%。低浓度氯化钙处理下，温度对黑麦草萌发几乎无影响，但当高浓度氯化钙处理时，温度对黑麦草种子萌发影响显著，在15 ℃/25 ℃时最佳。本研究证明，黑麦草是石灰岩地区生态恢复的优良物种，在利用其进行生态恢复时，需充分考虑当地气候和土壤中钙离子的含量。