贾红豆

（黑龙江八一农垦大学 生物技术中心，黑龙江 大庆 163319）

黄曲霉毒素是由生长在食品中的真菌（例如黄曲霉和寄生曲霉）作为次生代谢产物产生剧毒的化合物。黄曲霉毒素的主要关注点在于它们的致癌特性，这一点已通过大量动物实验和一些流行病学研究证明，黄曲霉毒素的暴露与肝癌发病率的增加有关。此外，肉、奶、蛋和其他动物来源产品中的黄曲霉毒素残留可能对人体健康造成额外危害。黄曲霉毒素B1（AFB1）污染的饲料喂养母牛的牛奶中检测出黄曲霉毒素M1（AFM1）的残留。此外，在牛的肌肉组织和鸡蛋中发现了黄曲霉毒素的残留[1]。在已知18种黄曲霉毒素中，黄曲霉毒素B1，B2，G1和G2被国际癌症研究机构视为A类致癌物。其中，黄曲霉毒素B1（AFB1）的毒性和致癌作用最为严重[2]。它需要氧化8，9-乙烯基键以产生具有生物活性的AFB1-8，9-环氧化合物，该化合物可以与DNA，RNA和蛋白质反应导致组织细胞损伤。

奶牛养殖中使用的许多饲料成分（棉籽、花生、玉米、大豆、大米、干鱼、虾和鱼粉）被认为是AFB1污染的主要来源。由于近年来饲料中霉菌毒素污染的问题日益严重，因此严重影响奶牛养殖业的健康发展。肝脏是动物机体主要的毒物代谢器官。AFB1进入肝脏后可以导致肝细胞氧化应激、凋亡损伤，诱导肝癌的发生。而AFB1对奶牛的毒性损伤报道较少。因此，本实验通过采用不同浓度的AFB1处理奶牛肝细胞，研究AFB1对奶牛肝细胞氧化应激及凋亡的影响，为防治AFB1对奶牛毒性损伤提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 奶牛肝细胞的分离、培养和处理

收集犊牛肝脏，以分离原代肝细胞。通过两步灌注法分离肝细胞[3]。无菌采集犊牛肝脏，将肝脏组织采用含有胶原酶的灌流液进行消化，随后剪碎肝脏。依次使用100目（150 μM）和200目（75 μM）的细胞筛过滤肝细胞。在RPMI-1640基本培养基中清洗2次后，将肝细胞悬液在4℃下以500×g离心5 min。将分离的肝细胞接种到6孔板中，并在37 ℃，5% CO2条件下培养。随后将分离和培养的奶牛肝细胞使用DMSO（对照组）及1、2和4 μM AFB1处理12 h。

1.2 ROS含量检测

用DCFH-DA染色测定法测量细胞内ROS浓度。将细胞与25 μM DCFH-DA孵育20 min，然后用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，并重悬于PBS中，通过流式细胞仪测量细胞内ROS的含量。

1.3 SOD和GSH-Px的活性以及MDA的含量检测

使用南京建城生物技术研究所（中国南京）的分光光度诊断试剂盒测定细胞中SOD和GSH-Px的活性以及MDA的含量。收集细胞并将其悬浮在PBS中，在560 nm（SOD），420 nm（GSH-Px）和532 nm（MDA）处检测吸光度，并使用722N分光光度计（上海科学仪器有限公司）记录吸光度。

1.4 蛋白提取和Western-blot实验

使用蛋白质提取试剂盒从肝细胞中分离总蛋白质，使用BCA方法检测蛋白质浓度。将蛋白质样品通过SDS-PAGE分离，并将其转移到0.45 m的PVDF膜上。在室温下，将膜用3%BSA Tris缓冲盐水/Tween缓冲液封闭4 h，然后与Caspase3和Caspase9抗体在4℃过夜。将膜洗涤3次，并与相应二抗在室温下孵育45 min。用ECL化学发光溶液检测蛋白条带。

1.5 凋亡率检测

收集细胞并用PBS洗涤2次，使用Annexin V-FITC/碘化丙啶凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡。根据说明书步骤进行操作，通过流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.6 统计分析

数据用平均值±标准差的表示。采用oneway ANOVA法进行数据分析。P＜0.05表示差异显著。P＜0.01表示差异极显著。

2 结果

2.1 AFB1对ROS和MDA含量的影响

为了研究检测AFB1是否可以诱导奶牛肝细胞氧化应激，本实验采用不同浓度AFB1处理奶牛肝细胞。结果如图1所示，与对照组相比，AFB1组奶牛肝细胞中ROS和MDA的含量显著升高。随着AFB1浓度升高，ROS和MDA的含量逐渐增加。说明AFB1可以诱导奶牛肝细胞氧化应激。

图1 ROS和MDA含量

2.2 AFB1对SOD和GSH-Px活性的影响

结果表明，与对照组相比，AFB1组奶牛肝细胞中SOD和GSH-Px活性显著降低（见图2）。随着AFB1浓度升高，SOD和GSH-Px活性逐渐下降。说明AFB1可以降低奶牛肝细胞抗氧化能力。

图2 SOD和GSH-Px活性

2.3 AFB1对Caspase3和Caspase9蛋白表达的影响

结果表明，与对照组相比，AFB1组奶牛肝细胞中Caspase3和Caspase9蛋白表达量显著升高（见图3）。随着AFB1浓度升高，Caspase3和Caspase9蛋白表达量逐渐增加。说明AFB1可以激活奶牛肝细胞Caspase凋亡通路。

图3 AFB1对Caspase3和Caspase9蛋白表达的影响

2.4 AFB1对奶牛肝细胞凋亡的影响

结果表明，与对照组相比，AFB1组奶牛肝细胞凋亡率显著升高（见图4）。随着AFB1浓度升高，凋亡率逐渐增加。说明AFB1可以诱导奶牛肝细胞凋亡。

图4 AFB1对奶牛肝细胞凋亡的影响

3 讨论

AFB1是毒性最高的黄曲霉毒素之一。研究发现AFB1对动物具有肝毒性，遗传毒性和免疫毒性作用[4]。由于AFB1存在于奶牛饲料中，且对奶牛具有肝毒性和免疫毒性，可以导致奶牛产奶量降低，奶中AFB1残留从而降低奶牛的生产性能。肝脏被认为是人类和动物中执行许多重要功能的最重要器官，同时也充当毒素的主要器官。大多数黄曲霉毒素（包括AFB1）在肝脏中以8，9-环氧形式结合DNA和蛋白质，诱导细胞凋亡，从而破坏肝脏的形态[5]。本研究发现，AFB1可以增加奶牛肝细胞中ROS和MDA的含量，降低肝细胞抗氧化能力，并激活Caspase凋亡通路，最终导致奶牛肝细胞凋亡。

氧化应激被认为是AFB1诱导肝毒性的关键因素。活性氧（ROS）的过度形成，细胞抗氧化能力降低会导致氧化应激的发生。在正常的细胞代谢过程中，线粒体产生ROS，包括氧离子，自由基和脂质氢过氧化物等[6]。然而，在没有抗氧化剂机制来抵消这些分子的过量产生的情况下，氧化应激可直接增加蛋白质和DNA的损伤并诱导脂质过氧化物的产生，如，丙二醛（MDA）[7]，最终导致不可逆转的细胞和组织损伤。研究发现AFB1可以导致豚鼠肝脏DNA和脂质损伤[8]。本研究发现，AFB1可以增加奶牛肝细胞中ROS和MDA的含量，且ROS和MDA的含量随着AFB1浓度增加而升高。这些研究说明AFB1可以导致奶牛肝细胞氧化损伤。SOD和GSH-Px是清除ROS的主要功能酶。本研究发现，AFB1可以降低奶牛肝细胞中SOD和GSH-Px的活性，且SOD和GSH-Px的活性随着AFB1浓度增加而降低。这些研究说明AFB1可以损害奶牛肝细胞抗氧化能力。

氧化应激导致细胞损伤的重要原因之一是导致细胞凋亡[9]。过量ROS的产生引起线粒体功能障碍，进而激活线粒体凋亡途径。Caspase信号通知在控制线粒体凋亡途径中起着关键作用。过量的ROS可激活Caspase9，活化的Caspase9裂解下游的caspase，如Caspase3，从而启动Caspase级联反应，导致细胞凋亡[10]。本研究发现，AFB1可以增加奶牛肝细胞中Caspase3和Caspase9蛋白表达量及细胞凋亡率，且Caspase3和Caspase9蛋白表达量及细胞凋亡率随着AFB1浓度增加而升高。这些研究说明AFB1可以激活ROS-Caspase凋亡通路，诱导奶牛肝细胞凋亡。

综上所述，本试验研究表明AFB1可以导致奶牛肝细胞氧化应激，随后激活Caspase凋亡通路，继而诱导奶牛肝细胞凋亡。