崔春婷，张建丽，黄 颖

黄芩(Scutellariae Radix)是我国的一味传统中药，来源于唇形科黄芩属植物黄芩(scutellaria baicalensis georgi)根部，迄今已有2 000多年的用药历史[1]。有研究表明，黄芩的主要有效成分是黄酮类化合物，主要包括黄芩苷(baicalin)、黄芩素(baicalein)和汉黄芩素(wogonin)等[2]。多项研究表明，黄芩中的黄芩苷具有显著的抗肿瘤活性及保护心血管作用[3-5]，但对心肌保护的具体机制尚不明确。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类长度为18～23个核苷酸的单链RNA分子，有研究表明，miRNA参与多种肿瘤的发生发展过程，在信号通路和基因调控方面具有重要的生物学作用[6]。相关研究表明，在心肌细胞缺氧损伤过程中，多种miRNA呈不同的变化趋势，其中miR-133b上调有利于保护心肌细胞[7-9]。本研究探讨黄芩苷对心肌细胞缺氧损伤的保护作用及分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验药物与试剂 黄芩苷购自普瑞法科技公司(批号：21967-41-9)，CoCl2购自国药集团，DMEM培养基和胎牛血清购自Gibco公司。实验用一抗购自Abcam公司，稀释比例1∶1 000。所有二抗和β-actin一抗购自中杉金桥公司。实验用小干扰RNA由百奥迈科公司设计并合成。

1.2 实验仪器 荧光倒置显微镜(日本奥林巴斯)，细胞培养瓶T-25(美国Corning)，六孔板(美国Corning)，流式细胞仪(美国BD)。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养 H9C2细胞使用含10%胎牛血清和100 U/mL青霉素-链霉素的DMEM培养基于37 ℃，5%CO2条件下培养。

1.3.2 缺氧复氧模型的构建 参考文献[10-11]选取CoCl2溶液5个梯度浓度(分别为400 μmol/L、600 μmol/L、800 μmol/L、1 000 μmol/L、1 200 μmol/L)作用于H9C2细胞22 h，之后使用完全培养液复氧2 h，检测细胞活力，确定实验用CoCl2浓度。

1.3.3 MTT实验 取缺氧复氧后细胞，以每孔3 000个细胞密度接种于96孔板中，培养24 h，待细胞贴壁后，弃上清液，每孔加入20 μL MTT溶液，37 ℃孵育4 h，弃掉MTT，每孔加入200 μL的二甲基亚砜(DMSO)于震荡仪上震荡溶解15 min，使用酶标仪于570 nm处测定吸光度，计算细胞增殖率。

1.3.4 流式细胞术 收集经处理的H9C2心肌细胞，磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤细胞两次，加入490 μL结合缓冲液重悬细胞，之后分别加入5 μL的Annexin V-FITC和5 μL的PI染液，室温避光孵育30 min，使用流式细胞仪检测。

1.3.5 蛋白质印迹实验 细胞以5×105/孔密度接种于6孔板中，经不同处理后，裂解并提取细胞总蛋白，使用BCA法测定蛋白浓度，具体步骤参考BCA试剂盒，蛋白电泳上样质量为每样本30 mg，具体步骤参考文献[12]。

1.3.6 实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR) 经过不同处理后，H9C2细胞中加入Trizol试剂，根据试剂盒说明提取总RNA，之后逆转录成cDNA模板后上机检测。

1.4 统计学处理 采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 H9C2细胞缺氧复氧损伤模型 使用1 000 μmol/L的CoCl2处理细胞22 h后，细胞活力为50%～60%，细胞活力下降程度适中，后续实验均采用此浓度建立H9C2心肌细胞缺氧复氧损伤模型。详见图1。

图1 不同浓度CoCl2建立心肌细胞缺氧复氧模型

2.2 黄芩苷对CoCl2诱导H9C2细胞活力的影响 使用不同浓度黄芩苷(分别为10 mg/L、25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L)和40 mg/L阳性药物丹参酮ⅡA磺酸钠预处理H9C2细胞0 h、24 h、48 h、72 h后，以1 000 μmol/L的CoCl2缺氧后复氧细胞。采用MTT法检测细胞活力。经黄芩苷预处理的细胞具有较高的细胞活力，预处理24 h时开始，各浓度组与0 h比较，差异有统计学意义(P<0.01)，但均未超过阳性对照组，详见图2。黄芩苷保护H9C2细胞活力具有浓度依赖性和时间依赖性。

与0 h比较，＊P<0.01。

2.3 黄芩苷对CoCl2诱导的H9C2细胞凋亡的影响 使用不同浓度黄芩苷(10 mg/L、25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L)和40 mg/L阳性药物丹参酮ⅡA磺酸钠预处理H9C2细胞24 h后按1 000 μmol/L的CoCl2使细胞缺氧后复氧。采用蛋白质印迹实验检测细胞Bax、Caspase-3和Bcl-2蛋白表达水平。经黄芩苷预处理的细胞具有较低的Caspase-3和Bax蛋白水平(P<0.01)和较高的Bcl-2蛋白水平(P<0.01)，但未超过阳性药物对照，详见图3。流式细胞术检测黄芩苷抑制心肌细胞凋亡具有浓度依赖性，详见表1。

图3 不同浓度黄芩苷和丹参酮ⅡA磺酸钠对细胞Bax、Caspase-3和Bcl-2蛋白水平的影响

表1 不同浓度黄芩苷和丹参酮ⅡA磺酸钠抑制心肌细胞凋亡的能力(x±s)

2.4 黄芩苷对miR-133b的影响 使用不同浓度黄芩苷(10 mg/L、25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L)预处理H9C2细胞24 h后按1 000 μmol/L的CoCl2使细胞缺氧后复氧，采用实时荧光定量PCR检测miR-133b表达情况。经黄芩苷预处理的细胞具有较高的miR-133b表达水平(P<0.01)，且呈浓度依赖性和时间依赖性。详见图4。

图4 不同浓度黄芩苷处理H9C2细胞不同时间miR-133b表达情况

2.5 黄芩苷保护心肌细胞依赖miR-133b的表达 使用商品化miR-133b抑制剂抑制H9C2细胞内源性miR-133b表达，详见图5。抑制miR-133b表达24 h后，以不同浓度黄芩苷(10 mg/L、25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L)预处理H9C2细胞0 h、24 h、48 h和72 h，之后按1 000 μmol/L的CoCl2使细胞缺氧后复氧。使用蛋白印迹实验检测Bax、Caspase-3和Bcl-2蛋白表达水平，miR-133b敲减后，黄芩苷对Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白水平无显著影响。详见图6。

与阳性对照药物比较，＊P<0.05。

图6 敲减miR-133b后黄芩苷对Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白水平的影响

3 讨 论

黄芩是我国历史悠久的传统中药材，具有清热燥湿、泻火解毒、止血安胎的功效。目前临床使用黄芩与其他传统中药材配伍治疗多种感染性疾病和过敏性疾病等。黄芩苷是黄芩中主要的有效成分之一，有研究证明黄芩苷具有抗氧化和抗肿瘤等生物学功能[13-14]。

心肌梗死是严重威胁人类生命健康的常见疾病，心肌细胞缺氧是引起心肌细胞凋亡进而导致心肌梗死的重要原因[15-16]。本研究参考相关文献[11]，利用CoCl2处理心肌细胞H9C2建立缺氧损伤模型，研究不同浓度黄芩苷对心肌细胞缺氧损伤的保护作用。本研究结果表明，黄芩苷可显著提高心肌细胞H9C2细胞活力，并抑制心肌细胞凋亡，其作用呈浓度依赖性。为进一步探讨黄芩苷保护心肌细胞的分子机制，本研究测定心肌细胞损伤相关miRNA表达情况。结果表明，黄芩苷预处理后的H9C2细胞miR-133b水平高表达，且这些细胞在缺氧复氧中表现出较高的细胞活力和较低的凋亡比例。为进一步分析与miR-133b相关的分子机制，本研究使用人工合成的特异性miR-133b抑制剂抑制细胞内源性miR-133b表达，结果证明，miR-133b被抑制后，黄芩苷对心肌细胞凋亡的保护作用消失。

综上所述，黄芩苷对CoCl2引起的心肌细胞缺氧复氧损伤具有保护作用，可提高细胞活力和抑制细胞凋亡。miR-133b在黄芩苷保护作用中发挥了重要功效，黄芩苷通过提高细胞内miR-133b表达进而发挥保护心肌细胞的作用。