干雅平，楼超艳，朱岩，甘露，陈佳萍

（1.杭州职业技术学院，浙江 杭州 310018；2.浙江大学 化学系，浙江 杭州 310000；3.浙江大学校医院，浙江杭州 310027）

海洋环境中，有机污染物种类繁多，对这些有机污染物进行监测和控制对海洋生态系统的保护具有重要意义。内分泌干扰物（endocrine disrupting compounds，EDCs）是一类广泛存在于海洋环境的重要外源性污染物质，也被称为环境激素（environmental hormones），这类化合物会干扰生物体内分泌系统的正常功能，影响人体的正常新陈代谢［1］。随着社会的进步和科技的发展，海洋生态安全越来越受关注，双酚类化合物（bisphenols，BPs）作为一类典型的内分泌干扰物，其在海洋环境中的分布亦广受关注［2］。双酚类化合物由2 个羟基苯酚通过桥接碳或其他化学结构键合而成，成本低廉、化学性质稳定。由于双酚类化合物具有良好的延展性，被广泛用作环氧树脂和聚碳酸酯（PC）塑料生产中的原料单体和聚氯乙烯（PVC）塑料的添加剂［3］。因双酚类化合物的无序排放，造成工业废水、城市污水、地表河流、海洋水体及其水体沉积物中含有大量双酚类污染物。因双酚类化合物可以模拟雌激素活性，长期接触或摄入此类化合物会降低人类的生育能力，对人类生殖发育产生极其不利的影响。研究表明，双酚类化合物还会导致乳腺癌、卵巢癌、睾丸癌等恶性肿瘤［4-5］，另外，对肾脏、神经系统等亦具有毒性［6-7］。因此，必须严格分析和检测海洋水体及沉积物中的双酚类化合物，以促进海洋生态环境的和谐发展。

建立快速、高效、绿色的分析方法，对海洋样品中双酚类化合物的检测至关重要。双酚类化合物的检测方法主要有高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）［8］、液相色谱串联质谱（liquid chromatography-mass spectrometry，LCMS）［9-10］、气相色谱串联质谱（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）［11-13］等，这些方法应用广泛，但均存在一定的不足。HPLC 法虽十分成熟，但对双酚类化合物的分离检测通常需要大量有毒有害有机溶剂作为流动相，对操作人员及生态环境都存在潜在的不利影响；LC-MS 法因连接了质谱检测器，方法灵敏且选择性佳，但仪器昂贵，设备维护费用高，难以全面普及；GC-MS 法通常需经衍生化处理才能对双酚类化合物进行分离检测，而衍生化过程耗时、费力，且需耗费大量有害溶剂，此外，在进行衍生化处理时，分析物的定量准确性通常不佳（存在潜在的分析物损失）。而超临界流体色谱（supercritical fluid chromatography，SFC）能有效克服上述方法的不足［14］。SFC 法是一种以超临界态二氧化碳流体为流动相的色谱分离技术，而超临界态二氧化碳流体兼具气体和液体的优点，流体黏度小，扩散性好，密度和溶解能力高（比气体高）、绿色、无毒、化学性能稳定且廉价，但因其为非极性流体，不具备分离洗脱双酚类化合物的能力，需要在其中加入少量极性改性剂以调节流动相的极性，实现对不同极性目标分析物的最佳分离。

对海洋水体、海洋沉积物等复杂海洋样品，由于样品基质较复杂，在对样品中的双酚类化合物进行检测时，应先做前处理以纯化样品。常用的前处理［15-16］方法有：固相萃取、分散固相萃取、固相微萃取、液液萃取（liquid-liquid phase extraction，LLE）等。本实验选择液液萃取，首先，用乙腈等有机溶剂，通过盐析作用辅助目标物在两相中的分配，萃取并去除样品中的水分和干扰基质。

本文建立了超临界流体色谱法用于分析海洋水体和沉积物中双酚A（BPAF）、双酚AF（BPA）、双酚C（BPC）、四溴双酚A（TBBPA）4 种双酚类化合物，先通过液液萃取对样品进行前处理，提取纯化样品，再通过优化超临界流体色谱条件，实现同时对4种双酚类化合物的分离检测。

1 实 验

1.1 试剂与仪器

超临界流体色谱仪为日本岛津公司旗下的Nexera UC 超临界流体色谱系统，采用紫外检测方法；SBL-5DTS超声波恒温清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；LG16B 高速离心机（雷勃尔，北京）；Millipore simplicity 超纯水机（美国Millipore公司）。

双酚类化合物标准品：BPAF（纯度99.0%）、BPA（纯度98.0%）、BPC（纯度98.0%）、TBBPA（纯度98.0%）购自阿拉丁化学品公司（中国），化学结构如图1 所示，在配制以上标准品的标准溶液时考虑纯度因子。HPLC 所需色谱纯级别的甲醇、乙腈等有机溶剂均购自Tedia 公司（美国）。氯化钠（分析纯）、无水硫酸镁（分析纯）均购自阿拉丁化学品公司（中国）。实验用水均为经Millipore simplicity 超纯水机（美国）净化的二次去离子水。将不同水域的海洋水体及沉积物样品保存于冰箱待用。

配制含有4 种双酚类化合物的甲醇储备液（200 mg·L-1）：准确称取适量的双酚类化合物标准物质，加入适量甲醇至标准物质完全溶解，转移至100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成200 mg·L-1的标准溶液，超声后低温储存备用。

配制含有4 种双酚类化合物的混合标准溶液：用甲醇逐级稀释标准溶液，得到不同浓度的混合标准溶液，低温保存，临配临用。

1.2 样品前处理

用移液枪准确量取海洋水体样品5.0 mL 于10 mL 离心管中，加入5 mL 乙腈混合均匀，溶液中加入1.0 g 无水硫酸镁和1.0 g 氯化钠，超声辅助萃取5 min，以10 000 r·min-1离心5 min，将上清液转移至自动进样样品瓶中，待SFC 进样分析，外标法定量。用天平称取海洋沉积物样品5.0 g，操作过程同上。

图1 4 种双酚的化学结构式Fig.1 Chemical structures of four bisphenols

1.3 超临界色谱分析条件

实验采用Nexera UC SFC 系统进行超临界流体色谱-紫外检测器法分析。该系统由超临界流体输送 泵（LD-30ADSF）、改 性 剂 输 送 泵（LC-20ADXR）、脱气单元（DGU-20A5R）、自动进样器（SIL-30A）、柱温箱（CTO-20AC）、系统背压调节器（SFC-30A）和系统控制器（CBM-20A）组成。双酚类化合物通过WondaCract ODS-2 色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mm，Shimadzu，日本）进行分离，采用超临界态CO2+10%（v/v）CH3OH 对流动相进行等度洗脱，总流速为2.0 mL·min-1、柱温为36 ℃、系统背压为12 MPa。经紫外全波长扫描，得到最佳检测波长为230 nm。为防止柱饱和，样品进样量为5 μL。

2 结果与讨论

2.1 前处理条件的优化

在实验中，海洋样品的纯化主要通过液液萃取完成，在液液萃取过程中，萃取溶剂种类的选择和超声萃取时间的优化对最终的萃取效果有重要影响。实验分别比较了甲醇、乙醇、乙腈和丙酮4 种萃取溶剂的萃取效果，4 种萃取溶剂对BPA、BPC、BPAF、TBBPA 等4 种双酚类化合物的萃取率如图2（a）所示。萃取过程中加入1.0 g 无水硫酸镁和1.0 g 氯化钠产生盐析作用，以促进双酚类化合物在两相中的分配，当乙腈作为萃取溶剂时，对实际样品中的双酚类化合物的萃取率最高，因此，选择乙腈作为最佳萃取溶剂。此外，在超声辅助下进行液液萃取，周期性的超声波频率可加快分子的传质过程，缩短萃取时间，提高萃取率。实验比较了不同萃取时间下（2～20 min），乙腈对目标物的萃取率如图2（b）所示，当萃取时间为5 min 时，对4 种双酚类化合物均有较高的萃取率，因此超声辅助萃取时间选择5 min。

图2 液液萃取过程中萃取溶剂的选择（a）和超声辅助萃取时间的优化（b）Fig.2 Selection of extraction solvent（a）and optimization of ultrasonic-assisted extraction time（b）for LLE

2.2 超临界流体色谱条件探讨

采用SFC 法对双酚类化合物进行分离，并对其分离条件进行优化。 双酚类化合物通过WondaCract ODS-2 色谱固定相（5 μm，4.6 mm×250 mm，Shimadzu，日本）在超临界流体色谱上进行分离，当以单一的非极性超临界态二氧化碳作为流动相时，对双酚类化合物的洗脱能力较弱，通过加入一定比例的极性改性剂，增强了流动相的洗脱效果，同时为使双酚类化合物在超临界流体色谱上得到最佳的分离效果，对柱温、流速、系统背压等超临界流体色谱参数进行了优化。通过探究极性改性剂的比例以及柱温、流速、系统背压等参数对双酚类化合物分离效果的影响，发现当柱温为36 ℃、流速为2.0 mL·min-1、系统背压为12 MPa，以超临界态二氧化碳/甲醇=90/10（v/v）为流动相时，4 种双酚类化合物均获得了最优的色谱峰及响应值。

2.2.1 极性改性剂的优化

本实验以甲醇作为极性改性剂，探究了不同流动相配比对分离效果的影响。当二氧化碳与甲醇体积比为8%～10%时，4 种双酚类化合物的保留时间如图3（a）所示，由此可知，随着二氧化碳与甲醇体积比的增加，流动相对4 种双酚类化合物的洗脱能力逐渐增强，综合考虑分离度和色谱峰形，最终选择二氧化碳/甲醇=90/10（v/v）作为流动相。

2.2.2 柱温、流速以及系统背压的优化

除对固定相和流动相进行优化外，对柱温、流速、系统背压等超临界流体色谱参数也进行了优化。总体来说，柱温、流速及系统背压的变化会改变流动相的密度，进而影响流动相对目标组分的溶剂化能力和洗脱能力，其对分离双酚类化合物的影响分别如图3（b）、（c）和（d）所示。在分离4 种双酚类化合物时，柱温升高会延长分离时间，且影响是非线性的，当柱温大于36 ℃时，流动相对目标化合物洗脱能力的影响逐渐减弱，见图3（b）。随着流速的增大，流动相的密度和洗脱能力增大，目标物在固定相上的保留时间随之缩短，见图3（c）。随着系统背压的升高，4 种双酚类化合物的洗脱时间逐渐缩短。综合考虑双酚类化合物的分离度和分离时间，最终选择柱温36 ℃、流速2.0 mL·min-1、系统背压12 MPa，实现了5 min 内对双酚类化合物的快速、完全分离。

图3 极性改性剂比例（a）、柱温（b）、流速（c）和系统背压（d）对分离的影响Fig.3 The effect of modifier percentage（a），temperature（b），flow rate（c），back pressure（d）on separation

2.3 线性关系及检出限

由于实际样品基质复杂多样，样品经前处理后可能存在基质干扰，因此对本方法的基质效应进行了评价。本实验中，前处理方法对实际样品中4 种双酚类化合物的基质效应范围均为−2.5%～4.1%，说明该方法可以有效消除基质干扰。考虑基质效应对实验结果影响极小，本实验采用外标法直接对目标物进行定量分析。将4 种双酚类化合物的甲醇溶液 配 制 成 质 量 浓 度 分 别 为0.10，0.20，0.50，1.00，2.00，5.00，20.0 mg·L-1的一系列混合标准溶液，利用外标法定量，绘制峰面积（Y）-浓度（X）标准曲线。线性范围、线性方程、线性相关系数、检出限（LODs）及定量限（LOQs）等结果见表1。由表1 可知，4 种双酚类化合物在线性范围内均具有良好的线性关系，线性相关系数均高于0.998 9，检出限为0.03～0.06 mg·L-1。

表1 4 种双酚类化合物的线性相关系数、检出限和定量限（n=5）Table 1 Linearity，correlation coefficient，LODs and LOQs of four target bisphenols（n=5）

2.4 样品分析

实验共选取3 处海域的海洋水体以及海洋沉积物作为实验样品，通过液液萃取对样品进行前处理，用超临界流体色谱法测定样品，得到：（1）在海域1的海洋水体样品和沉积物样品中均检出了BPAF，质 量 分 数 分 别 为0.086 和0.095 μg·mL-1，未 检 出BPA、BPC 和TBBPA；（2）在海域2 的海洋水体样品和沉积物样品中，4 种双酚类化合物均未检出；（3）在海域3 的海洋水体样品中检出了BPAF，质量分数为0.102 μg·mL-1，沉积物样品中4 种双酚类化合物均未检出。其中，海域1 沉积物样品4 的色谱图如图4 所示，超临界流体色谱法在5 min 内即可有效分离出4 种双酚类化合物。

图4 实际海洋样品和双酚类化合物标准溶液的超临界流体色谱谱图Fig.4 Chromatograms of marine samples and bisphenols standard solution separated by SFC

2.5 回收率及精密度

实验探究了4 种双酚类化合物在样品中的回收率，操作过程如下：

对实际样品进行0.10，0.20，0.50 mg·L-13 个浓度水平的加标回收率实验，每个浓度平行测定3 次，通过液液萃取对加标样品进行处理，采用SFC 法对加标样品进行测定，计算加标回收率，结果见表2。由表2 知，加标回收率为85.7%～112.0%；精密度≤10.3%，方法重现性佳。

4 结 论

内分泌干扰物是存在于海洋生态环境中具有持久性危害的外源性污染物质，双酚类化合物作为一类典型的内分泌干扰物对海洋生态环境具有重要影响，对海洋样品中双酚类化合物的浓度进行检测、追踪，对其分布进行监测，对海洋生态研究具有重要意义。建立了由液液萃取和超临界流体色谱法同时测定海洋水体及沉积物中的BPA、BPAF、BPC 和TBBPA 4 种双酚类化合物的方法，在线性浓度范围内4 种双酚类化合物均具有良好的线性，且线性相关系数均高于0.998 9，方法的检出限为0.03～0.06 mg·L-1，回收率为85.7%～112.0%，具有良好的重现性。实现了同时对海洋水体及沉积物中常见的双酚类化合物的快速检测，方法的选择性好、精密度和回收率高，且快速高效，可广泛应用于海洋环境中双酚类化合物的监测、追踪、风险研究及评估等工作。

表2 4 种双酚类化合物在空白海水样品中的回收率（n=3）Table 2 Recoveries of four bisphenols in blank marine samples（n=3）