高金霞 李秀元 牛莹莹 范兴君 谷红梅 杨勇 靳革

【摘要】 目的：探討环状RNA PVT1（circPVT1）在原发性非小细胞肺癌（NSCLC）患者组织和血液中的表达情况及其在NSCLC早期诊断的应用价值。方法：选取本院收治的68例NSCLC患者作为病例组，另选取同期于本院进行体检的68例正常人作为对照组。采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测病例组的肺癌组织与癌旁正常组织及两组血清circPVT1表达情况，分析circPVT1表达水平及其与NSCLC临床病理特征的关系，应用ROC曲线分析circPVT1对于NSCLC早期诊断的应用价值。结果：病例组肺癌组织circPVT1表达水平高于癌旁正常组织（P<0.05）。病例组血清circPVT1表达水平高于对照组（P<0.05）。不同性别、年龄、病理类型、肿瘤大小、组织学分化程度的肺癌组织circPVT1表达水平比较，差异均无统计学意义（P>0.05），是否吸烟、不同肿瘤分期、有无淋巴结转移的肺癌组织circPVT1表达水平比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。组织circPVT1表达水平诊断NSCLC的ROC曲线下面积为0.805[P<0.001，95%CI（0.731，0.880）]。血清circPVT1表达水平诊断NSCLC的ROC曲线下面积为0.782[P<0.001，95%CI（0.704，0.860）]。结论：circPVT1在NSCLC组织和血清中的表达水平均明显增高，肿瘤组织中circPVT1高表达与吸烟、肿瘤分期及淋巴结转移有关，circPVT1对于NSCLC具有一定的诊断价值。

【关键词】 NSCLC circPVT1 ROC曲线

Study on the Expression Level and Diagnostic Value of circPVT1 in Primary Non-small Cell Lung Cancer/GAO Jinxia， LI Xiuyuan， NIU Yingying， FAN Xingjun， GU Hongmei， YANG Yong， JIN Ge. //Medical Innovation of China， 2021， 18（31）： 0-014

[Abstract] Objective： To investigate the expression of circular RNA PVT1 （circPVT1） in tissues and blood of patients with primary non-small cell lung cancer （NSCLC） and its application value in early diagnosis of NSCLC. Method： A total of 68 NSCLC patients admitted to our hospital were selected as the case group， and 68 normal people who underwent physical examination in our hospital during the same period were selected as the control group. Real-time fluorescence quantitative PCR （RT-QPCR） was used to detect the expression of circPVT1 in lung cancer tissues and adjacent normal tissues as well as the serum of the two groups， the expression level of circPVT1 and its relationship with the clinicopathological features of NSCLC were analyzed， the application value of circPVT1 for the early diagnosis of NSCLC was analyzed by ROC curve. Result： The expression level of circPVT1 in lung cancer tissues was higher than that in adjacent normal tissues （P<0.05）. The serum circPVT1 expression level in case group was higher than that in control group （P<0.05）. There was no significant difference in the expression level of circPVT1 in lung cancer tissues of different genders， ages， pathological types， tumor sizes and histological differentiation degrees （P>0.05）， but there were statistically significant differences in circPVT1 expression levels in lung cancer tissues with or without smoking， different tumor stages and with or without lymph node metastasis （P<0.05）. The area under ROC curve for diagnosis of tissue circPVT1 expression level in NSCLC was 0.805 [P<0.001， 95%CI （0.731， 0.880）]. The area under ROC curve of serum circPVT1 expression level for diagnosis of NSCLC was 0.782 [P<0.001， 95%CI （0.704， 0.860）]. Conclusion： The expression level of circPVT1 in NSCLC tissues and serum was significantly increased， the high expression of circPVT1 is associated with smoking， tumor stage and lymph node metastasis， circPVT1 has a certain diagnostic value for NSCLC.

[Key words] NSCLC circPVT1 ROC curve

First-author’s address： School of Public Health of Mudanjiang Medical College， Mudanjiang 157011， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.31.003

肺癌已成为发病率及死亡率最高的恶性肿瘤，发病情况仍处于逐年上升的趋势，其中非小细胞肺癌（NSCLC）占比最高，达到80%～90%。肺癌高额的治疗费用，给家庭和社会带来了沉重的负担，且很多患者就诊时肺癌已经发展到中晚期，失去了治疗的最佳时机，目前手术、放化疗、免疫治疗、靶向治疗等各种方法的应用，5年生存率也仅15%左右[1]。因此，早期诊断、及早治疗才是提高肺癌治疗效果的重要方法[2]。环状RNA（circular RNAs，circRNAs）存在于真核生物细胞质中，由于其特殊的广泛性、保守性、稳定性等特征，有望成为肿瘤早期诊断的新的生物标记物[3]。circPVT1在许多肿瘤的发生发展中都起着重要作用，但关于circPVT1在肺癌中的表达情况的报道比较少见。本研究通过分析NSCLC患者组织及血液circPVT1的表达水平及其对于NSCLC的诊断价值，以期为肺癌的早期诊疗提供有价值的信息，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年1月-2019年12月于本院就诊的NSCLC患者68例作为病例组。纳入标准：经手术切除肺组织进行病理检测，确诊为NSCLC;本研究前未进行与肺癌相关的手术、放化療或生物学治疗。排除标准：合并其他恶性肿瘤;临床资料不全。另选取同期于本院体检的68例健康者作为对照组。所有研究对象均知情同意并签署知情同意书，本研究获得本院伦理委员会批准。

1.2 方法 病例组术中留取肺癌组织和癌旁正常组织（距病灶2 cm），放于离心管中，液氮冻存。两组抽取外周静脉血5 mL，以3 000 r/min离心10 min，吸取上清液存于EP管中，存于-80 ℃冰箱保存备用。采用Trizol法提取肺癌组织、癌旁正常组织及血清中总RNA，采用RNA反转录试剂盒和RT-PCR试剂盒将RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增。PCR引物由上海生工生物工程公司合成，内参GAPDH，以2-ΔΔCt表示目的基因的表达。circPVT1：正向引物CGACTCTTCCTGGTGAAGCATCTGAT;反向引物TACTTGAACGAAGCTCCATGCAGC;内参GADPH：正向引物GCACCGTCAAGGCTGAGAAC;反向引物ATGGTGGTGAAGACGCCAGT。

1.3 统计学处理 采用SPSS 23.0软件对所得数据进行统计分析，符合正态分布的计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验;不符合正态分布的计量资料用M（P25，P75）表示，比较采用秩和检验;计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验;采用ROC曲线分析血清及组织circPVT1表达水平对NSCLC的诊断价值。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料比较 病例组男41例，女27例;年龄38～81岁，平均（62.14±10.98）岁;吸烟者39例，不吸烟者29例;鳞癌37例，腺癌31例;TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期23例，Ⅲ～Ⅳ期45例。对照组男39例，女29例;年龄26～75岁，平均（53.26±13.53）岁;吸烟者40例，不吸烟者28例。两组性别年龄比较，差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

2.2 病例组肺癌组织与癌旁正常组织circPVT1表达水平比较 肺癌组织circPVT1相对表达量为0.176（0.049，0.291）高于癌旁正常组织的0.081（0.022，0.179），差异有统计学意义（P<0.01），见图1。

2.3 两组血清circPVT1表达水平比较 病例组血清circPVT1相对表达量为0.229（0.145，0.388）高于对照组的0.113（0.035，0.157），差异有统计学意义（P<0.01），见图2。

2.4 不同临床特征的NSCLC患者肺癌组织circPVT1表达水平比较 不同性别、年龄、病理类型、肿瘤大小、组织学分化程度NSCLC患者肺癌组织circPVT1表达水平比较，差异均无统计学意义（P>0.05）;是否吸烟、不同肿瘤分期及有无淋巴结转移NSCLC患者肺癌组织circPVT1表达水平比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.5 组织circPVT1表达水平对NSCLC的诊断价值 以癌旁正常组织circPVT1表达水平为对照，对circPVT1表达水平对NSCLC的诊断价值采用ROC曲线分析，曲线下面积（AUC）为0.805[P<0.001，95%CI（0.731，0.880）]，见图3。

2.6 血清circPVT1表达水平对NSCLC的诊断价值 以对照组血清circPVT1表达水平为对照，对circPVT1表达水平对NSCLC的诊断价值采用ROC曲线分析，AUC为0.782[P<0.001，95%CI（0.704，0.860）]，见图4。

3 讨论

环状RNA是单链非编码RNA，以共价闭合的连续环为特征。不同于线性RNA，它没有5’端帽子结构和3’端多聚A尾结构，而是3’和5’端直接联结形成一种闭合环状的特殊结构，这使其具备许多独特生物学特性及功能[4]。环状RNA在生物体内广泛存在，在血浆、外泌体等非组织中出现表达失调，体现出其无创、高效的早期诊断价值，以及对肿瘤变化实行动态监测等方面应用意义[5]，在多种疾病的发生发展中都体现出其重要作用，成为目前的研究热点。circPVT1是PVT1基因初始转录本中的一个外显子环化而形成的一种circRNA，位置处于染色体8q24上，拥有癌症易感基因位点和两个内含子侧翼（41466bP和35269bP），以及许多Alu重复序列[6]。circPVT1是与人类衰老相关的circRNA，通过调控let-7对靶基因的影响来抑制衰老[7]。其在肿瘤的发生、发展及预后中也体现出其重要价值，circPVT1在胃癌组织中呈现出高表达，并认为是胃癌预后独立的生物标志物[8]。circPVT1在乳腺癌组织及患者血清中均呈现高表达，有望成为乳腺癌早期诊断的潜在分子生物标志物[9]。

本研究结果显示，病例组血清circPVT1表达水平高于对照组（P<0.05），circPVT1在NSCLC组织中表达水平高于癌旁正常组织（P<0.05），且其高表达与吸烟、肿瘤分期及淋巴结转移有关（P<0.05），提示circRNAs在肺癌细胞的增殖、凋亡、侵袭、转移中扮演了重要的角色[10]。circRNA作为外泌体中的一类核酸分子，主要充當微小RNA（miRNA）海绵，发挥其在基因表达中的调控作用。外泌体通过运输大量的DNA、RNA和蛋白质等生物活性物质来参与细胞间的信息交换，抑制或启动受体细胞中的各种信号通路，发挥其在肿瘤转移中作用[11]。外泌体来源的circRNA大量存在于肿瘤患者的血浆中，故对肿瘤的增殖、转移和耐药进行调节[12]。吸烟是NSCLC中基因突变的危险因素，可能与烟草作为致癌物导致机体产生大量DNA加合物，进而造成呼吸道的细胞损伤有关。但很多研究更倾向于不吸烟人群，NSCLC中总体基因突变率与吸烟之间的关联[13]。对于研究结论的不一致，可能与本研究样本含量不大，且只是进行单一的基因检测有关，有待于进一步深入研究。

肺癌患者的诊断目前主要依赖CT影像学筛查、细胞穿刺活检、病理组织切片等方法，细胞学、组织学诊断虽然有较高的特异性，但敏感性较低。肿瘤生物标志物是在肿瘤的发生发展过程中，由肿瘤细胞合成、释放或宿主对肿瘤反应性释放的物质[14]，现在已逐步应用到肿瘤的早期诊断中，如通过检测组织或体液中特定circRNAs可以帮助诊断呼吸系统疾病[15-17]。本研究结果显示，组织和血清circPVT1诊断NSCLC的ROC曲线下面积分别为0.805和0.782，表明circPVT1对于NSCLC具有较高的诊断能力。很多研究均证实了血浆circRNA对于肺癌的诊断价值，WANG等[18]研究hsa_circ_0077837和hsa_circ_0001821两种circRNA对肺癌的诊断价值AUC分别为0.921和0.863，ZHAO等[19]研究中hsa_circ_0037515和hsa_circ_0037516两种circRNA对肺癌的诊断价值AUC分别为0.81和0.82，联合后AUC更是提高到0.9，表明血液circPVT1的诊断价值应用前景广阔。尤其是血液circPVT1的测定操作简单、成本低、侵入性小、更易于被患者所接受，circRNAs的环状结构使其不容易被核酸酶所分解，保持了高度的稳定性，使circPVT1作为NSCLC诊断标志物有天然的优势[20]，但尚需更大的样本量证实及对其作用机制进行更为深入的探索。

综上所述，circPVT1在NSCLC组织和血清中的表达水平明显增高，肿瘤组织中circPVT1高表达与吸烟、肿瘤分期及淋巴结转移有关，circPVT1对于NSCLC具有一定的诊断价值。在临床上通过对circPVT1表达的检测和分析判定，能够为NSCLC的早期诊断起到辅助性作用，有利于对肿瘤进行早期诊断、监测病情和评估预后。

参考文献

[1]李殿明，柳兆飞，宁国兰，等.细胞周期蛋白25A在非小细胞肺癌中的表达及与Let-7关系[J].南方医科大学学报，2020，40（11）：1622-1627.

[2]赵宝祥，李华，张亚君，等.microRNA-31联合CEA对肺癌早期诊断的临床意义[J].中国实验诊断学，2020，24（5）：763-766.

[3]许妍，赵雪，堵晶晶，等.环状RNA研究进展[J].中国生物工程杂志，2017，37（10）：99-108.

[4] Bachmayr H A，Reiner A T，Auer K，et al.Correlation of circular RNA abundance with Proliferation-exemplified with colorectal and ovarian cancer，idiopathic lung fibrosis，and normal human tissues[J].Sci ReP，2015，5（80）：8057.

[5]李勇，郭敏.环状RNA在肿瘤中的研究进展[J].医学研究杂志，2020，49（11）：21-24.

[6] Adhikary J，Chakraborty S，Dalal S，et al.CircularPVT1：an oncogenic non-coding RNA with emerging clinical importance[J].Journal of Clinical Pathology，2019，72（8）：513-519.

[7] Panda A C，Grammati K I，Kim K M，et al.Identification of senescence-associated circular RNAs（SAC-RNAs）reveals senescence suppressor CircPVT1[J].Nucleic Acids Research，2017，34（21）：6233-6246.

[8] CHEN J，LI Y，ZHENG Q P，et al.Circular RNA Profile identifies circPVT1 as a Proliferative factor and Prognostic marker in gastric cancer[J].Cancer Letters，2017，388：208-219.

[9]张雯琼，金春明，尹贵彬.circPVT1与lncGAS5在乳腺癌中的表达[J].牡丹江医学院学报，2019，40（6）：29-32.

[10] LI Y S，HU J H，LI L J，et al.Upregulated circular RNA circ_0016760 indicates unfavorable prognosis in NSCLC and promotes cell progression through miR-1287/GAGE1 axis[J].Biochem Biophys Res Commun，2018，503（3）：2089-2094.

[11] Mashouri L，Yousefi H，Aref A R，et al.Exosomes：composition，biogenesis，and mechanisms in cancer metastasis and drug resistance[J].Mol Cancer，2019，18（1）：75.

[12]文静，吕丽华，姚嘉怡，等.外泌体来源的环状RNA在肿瘤诊疗中的价值[J].检验医学，2020，35（12）：1213-1219.

[13]沈美頔，蔺红静，李峰，等.非小细胞肺癌基因突变与吸烟相关性的研究现状[J].现代肿瘤医学，2020，28（17）：3078-3080.

[14] CA724、CA153、PSA、HCG在肺癌患者病理类型诊断、临床分期及预后评估中的应用分析[J].临床肺科杂志，2020，25（9）：1405-1410.

[15] Haque S，Harries L W.Circular RNAs（circRNAs）in health and disease[J].Genes（Basel），2017，8（12）：353.

[16] WANG J F，ZHAO X H，WANG Y B，et al.circRNA-002178 act as a ceRNA to promote PDL1/PD1 expression in lung adenocarcinoma[J].Cell Death Dis，2020，11（1）：32.

[17] FAN C M，WANG J P，TANG Y Y，et al.circMAN1A2 could serve as a novel serum biomarker for malignant tumors[J].Cancer Sci，2019，110（7）：2180-2188.

[18] WANG C D，TAN S Y，LIU W R，et al.RNA-Seq profiling of circular RNA in human lung adenocarcinoma and squamous cell carcinoma[J].Mol Cancer，2019，18（1）：134.

[19] ZHAO D M，LIU H G，LIU H C，et al.Down regulated expression of hsa_circ_0037515 and hsa_circ_0037516 as novel biomarkers for nonsmall cell lung cancer[J].Am J Transl Res，2020，12（1）：162-170.

[20]徐康喬，夏世金，王坚，等.环状RNA与呼吸系统疾病[J].中国呼吸与危重监护杂志，2020，19（6）：611-616.

（收稿日期：2021-03-01） （本文编辑：田婧）

sdjzdx202203231640