邹娴，何燕华，何静怡，王艳，舒鼎铭，罗成龙

技术与方法

鸡原始生殖细胞转染条件优化

邹娴，何燕华，何静怡，王艳，舒鼎铭，罗成龙

广东省农业科学院动物科学研究所，畜禽育种国家重点实验室，广东省畜禽育种与营养研究重点实验室，广州 510640

为获得鸡原始生殖细胞(primordial germ cells, PGCs)的最佳转染效率，本研究比较不同质粒用量和不同细胞数在3种转染试剂(Lipofectamine 2000、3000和LTX & Plus Reagent)中PGCs的转染效率，利用荧光激活细胞分选技术(fluorescence activated cell sorting technology, FACS)辅助优化Lipofectamine 3000转染试剂，经FACS进一步分选获得带绿色荧光蛋白(GFP)的PGCs，继续培养3周后，移植回注到受体鸡胚中，移植3.5 d后分离性腺拍照观察。结果显示，转染试剂Lipofectamine 3000的转染效率最高，质粒、Lipofectamine 3000转染试剂和PGCs细胞数的配比为3 μg: 4 μL: 0.5×104个，转染5 h转染效率最高，达到23.4%，与现有的研究结果相比提高了2倍以上。移植回注PGCs到受体鸡胚中，荧光显微镜观察到鸡胚性腺中有GFP阳性细胞。本研究综合考虑转染试剂、质粒用量和细胞数量的影响因素以优化PGCs的转染条件，为高效制备转基因鸡及基因编辑鸡的研究奠定基础。

鸡；原始生殖细胞；稳定转染；脂质体

鸡()已被广泛用于早期胚胎发生、毒理学和干细胞等研究，特别是鸟类转基因和基因组编辑研究[1,2]。原始生殖细胞(primordial germ cells，PGCs)是精原细胞和卵原细胞的祖先细胞，能将遗传信息传递给下一代。鸡PGCs经过体外培养及基因修饰后，仍保持其生物学特性，移植回注到鸡胚血脉系统后可迁移到性腺并发育成功能性配子，产生转基因后代[3]。近年来，CRISPR/Cas9技术的发展及应用，使基因编辑鸟类模型成为可能，包括将LOXP位点导入鸡IgH位点、靶向卵球蛋白基因、标记基因插入Z染色体和抗J亚型禽白血病鸡模型[4~7]。……