黄宣运，杨光昕，史永富，黄冬梅，叶洪丽，蔡友琼

（1.中国水产科学研究院东海水产研究所，上海 200090；2.农业农村部水产品质量安全风险评估实验室（上海），上海 200090；3.上海海洋大学，农业农村部鱼类营养与环境生态研究中心，上海 201306；4.上海海洋大学，水产科学国家级实验教学示范中心，上海 201306）

亚甲基蓝（methylene blue，MB）是一种吩噻嗪类化合物［1］，最早被用于工业染色和治疗细菌性疟疾。近年来，亚甲基蓝被用于替代禁用药物孔雀石绿［2］防治水产动物养殖过程中的水霉病［3］。与孔雀石绿相比，亚甲基蓝毒性较低，但依然存在副作用［4-5］。目前，欧盟规定禁止亚甲基蓝用于动物食品生产过程，日本规定动物食品中亚甲基蓝最高残留限量为10μg·kg-1［6］。因此，建立一种简单、快捷的检测亚甲基蓝的方法显得十分必要。

现有检测动物源性食品中亚甲基蓝残留的方法主要有仪器法和免疫学分析法，仪器法主要包括紫外分光光度法［7-8］、液相色谱法［9］、液相色谱串联质谱法［10］等。与仪器法相比，免疫学分析法具有灵敏、快速、简单等优点，更适合用于水产品药物残留的初步筛查［11-13］。目前，基于免疫学原理开发的快速检测方法主要针对氟喹诺酮类［14-15］、孔雀石绿［16］等指标，对于亚甲基蓝尚未有相关研究报道。

本研究以亚甲基蓝代谢物天青C（azure C）作为亚甲基蓝的半抗原，采用戊二醛法合成亚甲基蓝人工抗原，并制备和鉴定了亚甲基蓝鼠源多克隆抗体，以期为下一步制备亚甲基蓝单克隆抗体及开发快速检测试剂盒提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

亚甲基蓝，含量≥98.9%，购自USP美国药典标准品公司；天青A，含量≥99.0%，购自山东西亚化学工业有限公司；天青B，含量≥95.1%，购自北京正翔科技有限公司；天青C，含量≥90%，购自Sigma公司；牛血清白蛋白（bovine serum album，BSA）、鸡卵血清白蛋白（ovalbumin，OVA）、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG（酶标二抗）、96孔酶标板、50%戊二醛（GA），购自生工生物工程（上海）公司；弗氏完全、不完全佐剂，购自Sigma公司；BALB／c小鼠购自上海吉辉实验动物饲养有限公司，许可证号为：SCXK（沪）2017-0012。本实验动物饲养于华东师范大学闵行校区实验动物中心，许可证号为：SYXK（沪）2015-0011。

本实验所用其他生物试剂纯度均大于98%，化学试剂均为分析纯及以上纯度。

Multifuge X3R离心机（赛默飞世尔（上海）仪器公司），U4100紫外分光光度计（株式会社日立制作所，日本），Multiskan MK3酶标仪（赛默飞世尔（上海）仪器公司）。

1.2 亚甲基蓝人工抗原的合成

参考滕海英等［17］的方法，对人工抗原进行合成。称取3.5 mg天青C溶解于2 mL磷酸盐缓冲溶液（PBS 0.01 mol·L-1，pH 7.2）中，加入50 μL 50% 戊二醛（GA）反应1 h。在室温磁力搅拌下，逐滴加入0.85 mL 20 mol·L-1的BSA溶液，再加入1.1mL PBS缓冲液，反应24 h。将溶液转移至处理好的透析袋中，并以PBS溶液为透析液在4℃透析3 d，每天更换透析液3～4次。透析后即为亚甲基蓝人工抗原（azure C-BSA），4℃保持备用，其合成路线见图1。azure C-VOA的制备方法与azure C-BSA一致，将OVA替换BSA即可。

1.3 亚甲基蓝人工抗原的鉴定

1.3.1 紫外扫描鉴定

用PBS将BSA、OVA、天青C和人工抗原稀释至适当浓度后，用紫外-可见分光光度计对其进行表征。

1.3.2 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MADLI-TOFMS）鉴定

人工抗原委托生工生物工程（上海）股份有限公司进行鉴定。具体方法如下：取1μL样品点至样品靶上，自然干燥后，再取CHCA基质溶液点至对应靶位上并自然干燥，用相同方法在样品靶位相邻位置点标准品。在正离子模式下选择线性方法对样品测试分子量。通过比较偶联蛋白、半抗原及人工抗原的分子量，计算偶联比。

图1 亚甲基蓝人工抗原合成路线Fig.1 Synthetic route of MB artificial antigen

1.4 多克隆抗体制备

挑选4只健康的6周龄的BALB／c小鼠，暂养1周后，免疫前眼眶取血作为阴性血清。取2 mg·mL-1免疫原（azure C-BSA）与弗氏完全佐剂等量混合，腹腔注射小鼠，免疫剂量为0.2 mg。首次免疫后2周，免疫原与弗氏不完全佐剂混合乳化，腹腔注射。以后免疫不加佐剂，分别在第3周、第4周、第5周各免疫一次，采用尾部静脉注射免疫。最后一次免疫后，摘眼球取血，离心分离血清后冻存备用。

1.5 多克隆抗体的鉴定

1.5.1 抗体效价测定

采用间接酶联免疫吸附检测方法（ELISA）检测抗体效价。将包被原稀释400倍后加入酶标板中，每孔100μL，37℃包被1 h。弃去废液，PBST（0.5% Tween-20）洗板3次（以下简称洗板），拍干。每孔加入200μL的PBS（5%的牛奶）封闭过夜，洗板，拍干，每孔加入100μL倍比稀释抗体，同时设置空白和阴性对照，37℃，1 h。洗板，拍干后加入羊抗鼠酶标二抗（1∶2 000稀释）37℃，0.5 h，洗板，拍干。每孔添加新配置的TMB显色液100μL，37℃，10min，加入2M H2SO450μL终止反应，用酶标仪在450 nm读数。以上清液吸光度为阴性值吸光度2倍（即P／N≥2.0）判断为阳性。

1.5.2 抗体灵敏度测定

利用方阵法，以OD450为1.0时，作为抗原抗体最佳反应浓度，配置不同浓度MB标准品，用间接竞争ELISA测不同浓度MB条件下的OD450，采用四参数Logisitic拟合标准曲线，公式为y=A2+（A1-A2）/［1+（X/X0）P］，其中A1为最大吸光度对应的浓度，A2为最小吸光度对应的浓度，X0为半数抑制浓度（IC50）对应的MB浓度，P为斜率。

1.5.3 抗体特异性测定

以亚甲基蓝代谢物天青A、天青B、天青C、孔雀石绿和结晶紫等作为竞争物，用间接竞争ELISA测定多抗对各竞争物的半数抑制浓度（IC50）。交叉反应率（cross reactivity，CR）为MB的IC50与各竞争物的IC50的百分比。

2 结果与讨论

2.1 半抗原的选择

亚甲基蓝是一个小分子化合物，其分子量只有319.9 Da，必须连接大分子物质，如BSA、OVA和钥孔血蓝蛋白（KLH）等才能够刺激机体产生抗体［18］。如图2所示，MB没有直接与蛋白质连接的功能基团（羧基和氨基），除了对MB进行化学改造接入连接功能基团外，利用结构类似物替代目标物作为半抗原，是一种最为简便的策略［19］。对于亚甲基蓝而言，其代谢物天青A或天青C不仅结构与其类似，而且有连接蛋白质的氨基基团，在本研究中选取天青C作为半抗原。

2.2 亚甲基蓝人工抗原的鉴定

2.2.1 紫外扫描鉴定

紫外扫描是鉴定人工抗原是否偶联成功最简单有效的方法［20］。在250～400 nm波长条件下，对天青C、BSA、OVA和人工抗原进行扫描，结果如图3所示，天青C、BSA、OVA、azure C-BSA和azure C-OVA的最大吸收峰分别为292 nm、278 nm、279 nm、260 nm和266 nm，与BSA和OVA相比较，人工抗原的最大吸收峰发生了蓝移，证明亚甲基蓝人工抗原制备成功。

2.2.2 MADLI-TOFMS鉴定

利用MADLI-TOF MS对BSA、OVA、azure CBSA、azure C-OVA的分子量进行鉴定，结果如图4所示，BSA的分子量为66 330.2 Da，azure CBSA分子量为74 134.2 Da。BSA上连接1个天青C 分子，分子量增加为249.7（Mr，azureC-Mr，H2O=277.7-18=249.7），因此azure C-BSA的偶联比约为31∶1，同理azure C-OVA的偶联比约为52∶1。

图2 不同化合物的分子结构示意图Fig.2 M olecular structure formula of different com pounds

2.3 多克隆抗体鉴定

2.3.1 抗体效价测定

最后一次免疫后，用ELISA测定血清效价，以阳性血清的OD450≥阴性对照的2倍作为血清的效价判断依据。从表1可以看出，4只小鼠均产生了抗体，效价均在1.6×104以上，其中2号小鼠效价最高，选取该抗体进行后续竞争实验。

图3 人工抗原紫外扫描图谱Fig.3 UV scanning spectrum of artificial antigen

图4 BSA（A）、azure C-BSA（B）、OVA（C）和azure C-OVA（D）质谱图Fig.4 MADLI-TOF MS spectrogram of BSA（A），azure C-BSA（B），OVA（C）and azure C-OVA（D）

2.3.2 抗体灵敏度

经方阵实验优化筛选，MB间接竞争ELISA测定最佳工作条件为包被原稀释400倍，包被酶标板；抗体稀释2 000倍；酶标二抗稀释2 000倍，反应时间为0.5 h。按上述实验条件测定抗体的灵敏度，利用Origin 16.0对测定结果进行四参数拟合，得到曲线方程为y=0.27+0.76/［1+（x/43.9）1.67］（图5），IC50值为43.9 ng·mL-1。

2.3.3 抗体特异性

通过优化的间接竞争ELISA法测定了9种物质与抗体的交叉反应。结果显示（表2）：抗体与目标物结构非常接近的天青A、天青B和天青C均有交叉反应，交叉反应率（CR）分别为127.6%、84.7%和138.1%。而与水产品中常见的其他药物几乎不存在交叉反应（CR＜0.01%）。由此说明，该抗体不仅可以高特异性地识别目标物（亚甲基蓝），而且能够识别与其结构相似的代谢物（天青A、天青B和天青C），这为下一步开发亚甲基蓝及其代谢物快速检测试剂盒奠定了基础。

图5 亚甲基蓝间接竞争ELISA方法标准曲线Fig.5 Standard ELISA inhibition curve of MB

表1 多克隆抗体效价测定Tab.1 Titers of polyclone antibody

3 小结

本实验以亚甲基蓝代谢物天青C作为亚甲基蓝半抗原，成功合成了亚甲基蓝人工抗原，免疫小鼠后，获得的多克隆抗体效价均在16 000以上，其中2号小鼠的多抗血清灵敏度最高，IC50为43.9 ng·mL-1，与天青A、天青B和天青C均有交叉反应，与水产品中常见其他药物几乎不存在交叉反应，说明该抗体特异性良好，为下一步制备亚甲基蓝单克隆抗体及开发免疫学快速检测方法奠定了基础。