张 强,席北斗,杨津津,李绍康,李 翔*,赵昕宇 (1.兰州交通大学环境与市政工程学院,甘肃 兰州730070；2.中国环境科学研究院环境基准与风险评估国家重点实验室,北京 100012；3.中国环境科学研究院国家环境保护地下水污染模拟与控制重点实验室,北京 100012)

堆肥是一种实现固体废物资源化和无害化的有效手段[1].世界上每年都会产生大量的有机固体废物,其产量持续增加将会对环境产生影响[2-3].堆肥过程可以产生稳定的有机产品腐殖质[4-5],其作为电子穿梭体具有修复土壤、降解和固定重金属或有机杂质的功能[6].腐殖质可以在生物地球化学循环的氧化还原过程中发挥重要作用,并在很大程度上影响环境中有机和无机污染物的氧化还原和降解[7-8].因此,调节高活性腐殖质成为了提高堆肥质量的一种手段.一般情况下,腐殖质被认为是由胡敏酸、富里酸和胡敏素三种成分组成[9-10].富里酸作为腐殖质的重要组分之一[11],具有较强的溶解性,移动性和污染物亲和力[12];富里酸可以将大分子营养物质及某些矿物质转化为小分子,使得营养物质更容易被微生物吸收利用,从而微生物活性增强[13].研究表明,富里酸具有一定的电子转移能力[14-15],这进一步说明了富里酸的重要性.然而,不同类型物料堆肥过程中形成的富里酸不尽相同.因此,有必要研究堆肥系统中富里酸的结构和变化.一直以来,人们致力于堆肥过程中富里酸组分含量变化的研究.但是,对于富里酸的结构和组成以及形成机理尚不清楚.

傅里叶变换红外光谱(FTIR)和三维荧光光谱(EEMs)是表征有机物相对简单且经济高效的方法.但是,由于许多分子信号的重叠,仅使用红外或荧光光谱通常无法为分子水平有机物的理解提供更多的信息[16].二维相关光谱(2DCOS)可以通过沿第二维扩展光谱提供有关分子结构变化的相对方向和顺序来区分重叠的峰[17].因此,在有机物研究中2DCOS 的新兴应用可以极大地增进人们对有机分子组成的相互作用和演化机理的理解.

基于此,本文针对富含木质纤维素类物料和富含木质素类物料堆肥过程中各个阶段形成的富里酸进行二维红外相关光谱分析,揭示堆肥不同阶段富里酸形成过程中的结构变化.基于三维荧光组分的二维荧光相关光谱与结构方程模型结合,揭示了不同物料堆肥过程中富里酸的结构组成及形成机理.

1 材料与方法

1.1 堆肥方法

堆肥试验场地为上海某堆肥厂,该堆肥厂面积为 12.4hm2,试验采集果蔬废物(FVW),杂草废物(WW),秸秆废物(SW)和园林修剪废物(GW)为堆肥原料.表1 显示了堆肥物料的初始有机成分,即半纤维素、纤维素和木质素.按有机成分可将FVW 和WW 划分为富含木质纤维素类物料,将SW 和GW划分为富含木质素类物料.堆体为条垛形式.平均每m3的堆肥物料约为0.75t,每个堆体高为1.5m、宽为3m,因此一个堆体堆肥物料约为10.6t.采用1%尿素或木屑调至其一致的C:N,范围为25～35:1.新鲜物料含水率较高,将其晒干,使其含水率在50%～60%.在堆肥过程中定期翻堆、通风,4 种堆肥到达高温期温度范围在 58～62℃,后又经历30d 的降温期.分别在堆肥升温期(0,2,5d)、高温期(6,8,10d)和降温期(15,25,35d)均匀采集堆体上、中、下、左、右5 个位点的样品,将样品均匀混合,以确保其一致性.采集样品总量为2kg,其中一部分的样品冻干备用,剩余储存于零下20℃冰箱.

表1 堆肥物料的初始有机成分Table 1 The initial organic composition of the compost material

1.2 富里酸的提取与纯化

腐殖酸提取方法采用国际腐殖酸协会(IHSS)的碱浸提方法:取3g 堆肥样品,按照1:10 固液比加入0.1mol/L NaOH 与0.1mol/L Na4P2O7混合液.在25℃条件下180r/min 浸提16h,4℃,10000r/min 离心20min,弃沉淀.上清液过0.45μm 滤膜,即为腐殖酸提取液.取一定量腐殖酸提取液,用6mol/L HCl 调至pH 值至1.0,静置12h 后溶液中出现沉淀物质,其中沉淀是不易溶于酸性条件的胡敏酸组分,上清液是酸溶性富里酸组分.混合溶液4℃、10000r/min离心10min,使沉淀和溶液分离.获得的上清液利用XAD-7 交换树脂进行纯化,去除其中的亲水性杂质组分,即获得纯净的富里酸溶液,一部分冻干后用于红外光谱测定.

1.3 富里酸化学结构特征分析

1.3.1 红外光谱测定 将 1mg 冻干的富里酸(Fulvic acid, FA)样品与300mg 光谱级干燥的KBr混合,然后将混合物在10000kPa 下加压2min.使用Nicolet Nexus FTIR 分光光度计,以4000～400cm-1的分辨率测量FTIR 光谱.

1.3.2 富里酸三维荧光光谱的扫描 扫描光谱之前,将样品TOC 调为10mg/L.狭缝宽带:Ex=5nm;Em=5nm;扫描速度为1200nm/min,PMT电压为700V,信噪比＞110;响应时间:自动.样品荧光光谱扫描参数如下:发射光谱:发射波长(Em)扫描范围为280～550nm,对应激发波长(Ex)的扫描范围为200～450nm.固定波长差Δλ=Em—Ex=55nm.

1.4 二维相关光谱

本文中,堆肥样品分为富含木质纤维素和富含木质素两类,FTIR 和EEMs 的2DCOS 两种类别的FTIR/EEMs 荧光值均获得.y 的2D 光谱变化可以是外部变量和n 个等距点处的光谱变量的函数,可以表示为:

动态光谱y(x,C)的清晰定义如下:

通过离散Hilbert-Noda 变换生成了两个图(同步(Ф)和异步(Ψ)相关谱):

二维相关性分析提供了2 个不同的图形.同步图显示了在实验过程中每个波段变化的相关性,以及它们之间的相关性是增加还是减少.异步相关图将该信息与发生的事件顺序相关联[18].

1.5 数据分析

将两类物料在3 个阶段(升温期、高温期、降温期)的富里酸样品转化为三维的数据矩阵(21×50×55Em), 在MATLAB2019a(Mathworks, Natick,MA)上的DOMFluor toolbox(www.models. life.ku.dk)使用平行因子对三维数据矩阵进行解析.通过Origin 2018 处理平行因子得到的Fmax 值来表示样品中不同组分的相对含量.然后将两类物料平行因子分析结果中的EX loading 数据通过2D shige 软件进行二维相关分析.将3 个阶段的富里酸的红外原始光谱导入Origin2018 软件,然后通过峰值拟合功能自动得到红外官能团的相对含量.最后用SPSS Amos23 构建结构方程模型(SEM).在进行SEM 分析之前,自回归相关结构用于识别IBM SPSS AMOS 23 数据中的潜在自相关.本文在AMOS23 软件中使用卡方检验来检验拟合的质量,例如,如果P值＞ 0.05,则此模型比较可靠.最后,迭代地删除所有不重要的缺失路径,并每次都重新测试模型的可靠性.此外,本文使用SEM 的标准化总效果来验证模型中的间接和直接关系.

2 结果与讨论

2.1 不同类型物料富里酸荧光组分分析

为研究不同类型物料堆肥过程中形成的富里酸组成及组分变化,采用平行因子分析法(PARAFAC)对富里酸的荧光光谱进行解析.如图1所示,富含木质纤维类物料堆肥形成的富里酸的组分1(C1),在Ex/Em 波长为230(330)nm/415nm 时具有次要和主要荧光峰.该组分为类富里酸类物质[19].而富含木质素类物料堆肥形成的富里酸的类富里酸组分C1,只在Ex/Em 波长为330nm/415nm 时具有一个主要荧光峰.说明木质纤维素类物料堆肥形成富里酸的过程中有助于形成230nm 处的峰,而木质素类物料堆肥形成富里酸的过程中有助于减少230nm 处的峰.较短波长的成分往往是结构简单的低分子量物质[20-21],很容易被微生物降解.不同来源富里酸组分2(C2)的荧光峰,表现出相同的激发/发射(Ex/Em)波长.并且都在Ex/Em 波长为225(275)nm/350nm 时具有次要和主要荧光峰.在Ex/Em 波长225(275)nm/350nm 为类酪氨酸类物质[22-23],说明两类物料堆肥都形成了类酪氨酸组分C2,该峰不仅与酪氨酸类物质相关,还与可溶性微生物代谢副产物和苯环类物质有关[24].不同来源富里酸组分3(C3)的荧光峰,表现出相同的激发/发射(Ex/Em)波长.并且都在Ex/Em 波长为225nm/300nm 时具有主要荧光峰.根据已有文献表明,在Ex/Em 波长225nm/300nm处为类色氨酸类物质[25].即两类物料堆肥都形成了类色氨酸组分C3,由此可知,在堆肥过程中微生物以类色氨酸物质为碳源.

2.2 不同来源富里酸不同阶段组分及官能团变化

红外光谱用于鉴定富里酸中存在的官能团.使用特征吸收带的强度确定富里酸中官能团的相对含量(图 2a).966cm-1附近出现的峰是芳环上的δ(CH)的振动[26],1650cm-1附近出现的峰是归因于as(COO)的振动[27],2866cm-1附近出现的峰通常表示脂肪族基团附近的as(CH3)和(CH2)的振动[28-29].在WW 和SW 中,芳环的含量分别增加了约10%和5%,这说明富里酸的芳构化可能发生在中后期;并且WW 堆肥形成的富里酸中芳环含量较高,说明富含纤维素类物料堆肥形成的富里酸结构更稳定.并且在WW 和SW 中,脂肪族的含量分别下降了约10%和6%,这说明堆肥形成富里酸的时候可能以脂肪族为碳源;并且WW 堆肥形成的富里酸中脂肪族含量减少更多,说明富含木质纤维素类物料堆肥过程中脂肪族更容易被降解.

图1 两类物料堆肥形成富里酸的三维荧光平行因子分析组分图Fig.1 Three-dimensional fluorescence parallel factor analysis component composition of fulvic acid formed by composting two types of materials

基于荧光光谱-平行因子分析,根据荧光组分得 分值Fmax 变化,得到不同物料堆肥过程中形成的富里酸组分的变化(图2b).根据EEM-PARAFAC 结果可知,除SW 外,其它物料在堆肥的升温期,类色氨酸组分C3 含量最高,随着堆肥的进行该荧光组分所占比例有所降低,而类富里酸物质的荧光组分C1 所占比例呈增加趋势.这是因为随着堆肥进行,富里酸中类色氨酸组分C3 随微生物降解其百分含量逐渐降低,逐渐转化为类富里酸类物质[30].类富里酸是结构较为稳定的组分,这源于堆肥过程微生物对木质素与纤维素类物质的降解[31].C2 在堆肥过程无明显变化,这代表了酪氨酸与苯醌类物质含量的综合变化.从图2b 还可以看出,除GW 外,FVW 和WW 堆肥形成的富里酸中组分3 的减少量远高于SW.说明富含木质纤维素类物料堆肥形成的富里酸中的类色氨酸更容易被降解为较稳定的类富里酸组分C1,即富含木质纤维素类物料堆肥形成的富里酸更稳定.与红外分析得出的结论一致.

图2 两类物料在不同堆肥阶段形成的富里酸组分含量占比Fig.2 The percentage of fulvic acid components formed by composting two types of materials

2.3 不同来源堆肥过程富里酸的结构演化

如图3a 所示,在波长对220/220、275/275 和330/330 处观察到3 个自动峰值,并且在波长对280～330 / 220 处检测到负交叉峰;图3b 中检测到以275/220和330/275的波长对为中心的2个正交叉峰.此外,在图中的波长对275/240 和330/220 处观察到2 个负交叉峰.根据Noda 的规则[32],这些观察结果可以解释为荧光光谱中优先荧光强度发生变化的顺序是330nm＞220nm＞275nm 和240nm＞275nm.以上结果表明,木质纤维素类物料堆肥形成的富里酸中各组分变化顺序如下:类色氨酸物质＞类富里酸物质和类酪氨酸物质＞类富里酸物质.

如图3b 所示,在波长对220/220 和330/330 处观察到2 个自动峰值,并且在波长280～350/220 处检测到负交叉峰;图3b 中检测到以275/220 和330/275的波长对为中心的2 个正交叉峰.此外,在图中的波长对275/240 和380/220 处观察到2 个负交叉峰.根据Noda 的规则[32],这些观察结果可以解释为荧光光谱中优先荧光强度发生变化的顺序是 380nm＞220nm＞275nm和330nm＞275nm以及240nm＞275nm.以上结果表明,木质素类物料堆肥形成的富里酸中各组分变化顺序如下:类色氨酸物质和类酪氨酸物质＞类富里酸物质.通过对比,发现不同物料堆肥形成的FA 中荧光组分变化顺序基本相同,说明这些大分子物质的形成存在一定规律.

为了得到不同来源富里酸内部结构的详细演变,本文通过红外光谱和荧光光谱进行了二维异质光谱分析.如图4a所示,在波长对840/220～360处检测到正交叉峰,在异步图4b 中观察到波长对840/240 和840/285～390 的2 处负交叉峰.通过判断规则,木质纤维素类物料堆肥形成的FA 中组分变化顺序是240＞840 和285～390＞840.以上结果表明,木质纤维素类物料堆肥形成的富里酸中各组分变化顺序如下,类色氨酸、类酪氨酸、类富里酸＞脂肪族基团和芳环.

图3 富含木质纤维素和木质素的物料堆肥形成的富里酸的二维荧光光谱Fig.3 Two-dimensional fluorescence spectrum of fulvic acid formed by composting materials rich in lignocellulose and lignin

图4 富含木质纤维素和木质素类物料堆肥形成的富里酸的二维红外-荧光异质光谱Fig.4 Two-dimensional infrared-fluorescence heterogeneous spectrum of fulvic acid formed by composting lignocellulose and lignin-like materials

如图4c 所示,在波长对870/265～360、1650/220和3250/220 处检测到正交叉峰,在异步图4b 中观察到波长3250/220 处的负交叉峰以及840/295～380 处的正交叉峰.通过判断规则,木质纤维素类物料堆肥形成的FA 中组分变化顺序是220＞3250 和840＞295～380.以上结果表明,木质素类物料堆肥形成的富里酸中各组分变化顺序如下,类酪氨酸＞羧基和醇基;芳环和脂族基团＞类酪氨酸.

2.4 不同物料堆肥形成的富里酸组分间的关系

通过结构方程模型来检测富里酸各成分之间的直接或间接影响(图5).结果表明,类富里酸与类色氨酸(λ=-0.840,P＜0.05)(图5a)的形成显著相关;类酪氨酸与类色氨酸(λ=0.898,P＜0.05)(图5b)的形成显著相关;羧基与类酪氨酸(λ=0.687,P＜0.05)(图5b)的形成显著相关.此外可以看出芳环与类富里酸(λ=0.546,P＜0.05)(图5a)、羧基(λ=0.715,P＜0.05)(图5a)及脂肪基团(λ=0.546,P＜0.05)(图5b)的形成显著相关.

图5 不同物料堆肥形成的富里酸中不同组分间的关系Fig.5 Relationship between different components in fulvic acid formed by composting different materials

3 结语

尽管富含木质纤维素类物料和富含木质素类物料的荧光组分含量及变化基本相似,但是两类堆肥物料形成的富里酸结构存在显著差异,并且特征官能团与其荧光组分的形成先后顺序不同.在木质纤维素类堆肥过程中,富里酸结构中类酪氨酸和类色氨酸的形成优先于芳环;而在木质类堆肥过程中,富里酸中的芳环的形成优先于类酪氨酸和类色氨酸.此外,类富里酸,脂肪族基团和羧基是影响富里酸中芳环形成的关键基团与组分.