（云南省林业和草原科学院 a.云南省森林植物培育与开发利用重点实验室；b.国家林业和草原局云南珍稀濒特森林植物保护和繁育重点实验室，云南 昆明 650201）

云南蓝果树Nyssa yunnanensis是云南省特有的极小种群野生植物[1]。目前，已对云南蓝果树实施了就地保护、近地保护、迁地保护、种苗繁育和回归引种等系列的拯救保护措施，建立了云南蓝果树保护小区及其保护管理机构、种苗繁育基地、近地和迁地保护基地，并进行了回归引种试验示范，使云南蓝果树种群得到了较为充分的保护和恢复[2-3]。

种苗繁育是云南蓝果树拯救保护的重要环节[2]。前期开展了云南蓝果树种子萌发特性的研究[4]，可以通过人工破坏果皮、碱液或赤霉素处理等促进其种子萌发[5]。但是，关于云南蓝果树苗木培育的研究甚少，尤其是苗木生长过程中的肥料配比研究仍是空白。另外，云南蓝果树的近地保护、迁地保护和回归引种等保护实践的种群监测发现，云南蓝果树苗木移栽后存活率较低，这或许与云南蓝果树幼苗抗旱性较差有关。前期研究发现水杨酸浸种处理一定程度上可增强其早期幼苗叶片内SOD、POD、CAT 活性、Pro、可溶性糖的含量，降低MDA 含量，进而增强其抗旱性[6]。那么，如何进行苗期处理进而提高云南蓝果树苗木的抗旱性，目前未见报道。

合理施肥可增加植物的抗逆性，是提高作物产量和改善品质的有效途径[7]。尤其是在水分亏缺的条件下，适当施用氮磷钾肥可提高多种植物叶片中可溶性蛋白、MDA、过氧化物酶和过氧化氢酶等抗旱性生理指标的含量，进而提高其抗旱性[8-9]。作为抗旱性较差的云南蓝果树，适当施肥是否可以促进其生理生化性质的改变，进而提高其在野外的适应性，值得研究。

因此，为了建立云南蓝果树幼苗最佳施肥技术方案，本研究根据农业部《测土配方施肥技术规范（2011 修订版）》中的“3414”肥料效应试验[10-11]，以其生理生化指标作为其质量控制指标，对云南蓝果树幼苗开展施肥效应试验，研究不同氮磷钾施肥对云南蓝果树幼苗生理指标的影响，进而确定最佳施肥量，扩大云南蓝果树种苗繁育规模，增加苗木培育数量，用于云南蓝果树的种群恢复与重建。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验用云南蓝果树苗木为来自同一个种源地的1年生容器苗。育苗容器为直径20 cm 的花盆，培养基质为石英砂（3.3 kg）。试验开始前先将石英砂在次氯酸钠（NaClO）中浸泡48 h，洗净后120℃烘8 h。2017年4月中旬在温室苗床内选择生长健壮、苗高相近的云南蓝果树幼苗，将其移植入已准备好的容器内。

供施肥料为尿素（含纯氮46%N）、磷肥（含12%P2O5）和钾肥（含60%K2O）。

1.2 试验设计

试验于云南省林业和草原科学院温室中进行，自然温度和自然光照。采用现代肥料二次回归“3414”试验设计，设计氮磷钾3 个因素，每个因素4 水平，共计14 个处理，每个处理10 个重复。设计中各4 个因素水平的含义：0 水平指不施肥，2 水平指当地最佳施肥量，1 水平=2 水平×0.5，3 水平=2 水平×1.5（该水平为过量施肥水平）。分别在7月17日、8月6日和8月26日施肥，试验期间的管理抚育措施一致。具体的“3414”施肥试验设计见表1。

1.3 取样与测定项目及方法

试验结束前，采集叶片用来测定抗旱性相关酶活性和渗透调节物质的含量。本试验选取过氧化物酶（POD）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、脯氨酸（Pro）、过氧化氢酶（CAT）和可溶性蛋白质（SP）等植物抗旱性密切相关的生理指标进行了测定。蛋白质浓度（SP）的测定采用BCA（bicinchonininc acid）法；过氧化物酶活性（POD）的测定采用愈创木酚比色法[12]；超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性采用试剂盒（上海生工生物）进行测定；脯氨酸（Pro）含量的测定采用磺基水杨酸提取法；丙二醛（MDA）含量的测定采用硫代巴比妥酸法（TBA）[13]。

表1 云南蓝果树幼苗“3414”肥料试验N、P、K 因素水平Table 1 The levels of N,P and K factors in the “3414” fertilizer efficiency of Nyssa yunnanensis seedlings

1.4 数据处理与分析

采用Excel 软件进行回归分析和作图，并用SPSS16.0 软件对数据进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同氮磷钾施肥处理对云南蓝果树幼苗叶片生理指标的影响

由表2可知，施肥处理条件下，云南蓝果树的各项生理指标均高于不施肥处理（N0P0K0）。施肥处理中，以N2P2K1处理的各项生理指标最高，其次是N2P1K2、N2P0K2和N2P2K2；综合各项生理指标，最低的为N0P2K2，其次是N2P3K2、N1P1K2和N3P2K2。对比缺氮（N0P2K2）、缺磷（N2P0K2）、缺钾（N2P2K0）3 个处理的生理指标，表现为不施肥＜缺氮＜缺钾＜缺磷，说明云南蓝果树幼苗对氮肥的依懒性最强。

2.2 氮、磷、钾最佳施肥量的确定

以云南蓝果树的各项生理指标作为因变量，氮磷钾肥施用量作为自变量进行一元二次方程回归分析，结果如表3所示。当施氮、磷、钾肥量分别为0.15%～0.18%、0.02%～0.04%和0.08%～0.11%时，可以保证云南蓝果树的生理指标最佳。

表2 不同施肥处理对云南蓝果树幼苗生理指标的影响†Table 2 Effects of different fertilization treatments on physiological indicators of Nyssa yunnanensis seedlings

表3 云南蓝果树生理指标与氮、磷、钾肥的回归关系Table 3 Regression relationship between physiological indicators and fertilizers of Nyssa yunnanensis

2.3 云南蓝果树氮磷钾的互作效应对生理指标的影响

2.3.1 磷、钾肥对氮肥施用效果的作用

从图1可知，当钾肥和磷肥施用量为中等水平（K2和P2）时，除了MDA，云南蓝果树幼苗的SP、CAT、POD、SOD、Pro 等生理指标均在低氮（N1）处理时随施钾（磷）量的增加而增加，在中氮（N2）处理时随施钾（磷）量的增加而降低。

当钾肥施用量在K2水平时，N1处理下叶片的SP、CAT、POD、SOD、Pro 随着施磷量的增加而增加，分别增加了8.24%、27.92%、5.78%、4.87%、4.93%，而MDA 减少了16.61%；在N2处理水平时，叶片SP、CAT、POD、SOD、Pro 表现为随着施磷量的增加而减少，分别减少了6.31%、114.16%、25.85%、13.01%、2.08%，MDA 增加了34.41%。当磷肥施用量在P2水平时，在N1处理下叶片的SP、CAT、POD、SOD、Pro 随着施钾量的增加而增加，增长率分别为6.76%、27.55%、16.07%、12.22%、7.17%，MDA 减少了16.61%；在N2处理水平时，叶片SP、CAT、POD、SOD、Pro 表现为随着施钾量的增加而降低，减少率分别为26.83%、121.56%、46.29%、24.86%、8.00%，MDA 增加了37.38%。由此可见，N1水平时，磷钾肥的施用对叶片生理指标有影响，中磷、中钾（P2K2）处理的叶片各项生理指标结果较好，但是差异不显著；N2水平时，中磷、中钾（P2K2）处理的叶片各项生理指标结果较差，在中磷、低钾（P2K1）水平时的生理指标优于其他处理，说明中磷、低钾（P2K1）水平更利于氮肥效果的发挥。

2.3.2 氮、钾肥对磷肥施用效果的作用

如图2所示，当钾为中等（K2）水平时，低磷（P1）处理水平的叶片SP、CAT、SOD、Pro 含量随施氮量的增加而逐渐增加，增长率分别为27.72%、4.64%、11.27%、2.76%，POD、MDA 含量减少了0.86%、33.36%；中磷（P2）水平时，随着施氮量的增加，叶片SP、SOD、Pro 逐渐增加，增长率为10.99%、11.27%、10.07%，CAT、POD、MDA分别减少4.64%、0.86%、33.36%。

当氮为中等（N2）水平时，低磷（P1）处理的SP、CAT、POD、SOD 和Pro 随施钾量的增加而增加，增长率分别为21.30%、110.49%、35.24%、32.58%、9.05%，MDA 减少了87.21%，而中磷（P2）处理的生理指标变化与之相反，即叶片的SP、CAT、POD、SOD、Pro 分别减少了26.83%、121.56%、46.29%、24.86%、8.00%，MDA 增加了37.38%。

因此，氮钾肥施用对磷肥的效果不明显，中氮中钾（N2K2）水平时，生理指标只在低磷（P1）时较高，而在中氮低钾（N2K1）水平时，中磷水平（P2）下的数值最高，说明中氮低钾（N2K1）水平利于磷肥效果的发挥。

图1 磷、钾肥对氮肥施用效果的作用Fig.1 Effects of phosphorus and potassium fertilizer on nitrogen efficiency

图2 氮、钾肥对磷肥施用效果的作用Fig.2 Effects of nitrogen and potassium fertilizer on phosphorus efficiency

续图2Continuation of Fig.2

2.3.3 氮、磷肥对钾肥施用效果的作用

图3显示，氮肥为N2水平时，随着施磷量的增加，低钾（K1）水平处理的叶片SP、CAT、POD、SOD、Pro 含量逐渐增加，分别增长了44.71%、117.76%、57.20%、46.49%、15.37%，MDA 含量减少了91.35%；而中钾（K2）水平时，叶片SP、CAT、POD、SOD、Pro 含量逐渐减少，减少率为6.31%、114.16%、25.85%、13.01%、2.08%，MDA 含量增加了34.41%。

图3 氮、磷肥对钾肥施用效果的作用Fig.3 Effect of nitrogen and phosphorus fertilizer on potassium efficiency

磷肥为中磷水平（P2）时，随着施氮量的增加，低钾（K1）条件下叶片的SP、CAT、POD、SOD、Pro 含量随之分别增长了50.29%、184.25%、68.35%、55.92%、18.94%，MDA 含 量 减 少 了113.66%；中钾（K2）水平时，叶片BCA、SOD、Pro 含量随之分别增长了10.99%、11.27%、2.76%，而CAT、POD、MDA 含量分别降低了4.64%、0.86%、33.36%。在低钾（K1）水平时，叶片各生理指标在低氮中磷（N1P2）和中氮低磷（N2P1）水平时变化不大，在中氮中磷（N2P2）水平时达到最佳；叶片SP、POD、Pro、SOD 指标在中钾（K2）水平时，增幅不明显，说明在中氮中磷（N2P2）水平时利于钾肥肥效的发挥（图3）。云南蓝果树在中氮、中磷、低钾（N2P2K1）水平下的各项生理指标表现最佳，说明中氮中磷（N2P2）水平有利于钾肥效果的发挥。

3 讨论与结论

氮磷钾是植物生长发育必不可少的重要营养元素，影响植物体内的一系列生理生化过程[14]。植物生长发育过程氮是必需的大量元素之一，氮素水平与植物的酶活性及叶绿素都有密切联系。研究表明，适当地施加氮肥可以促进植物生长，提高光合速率和抗氧化酶活性。磷元素是植物体内的大量元素，主要对植物的生长发育有重要作用，大量的施肥试验表明磷元素对植株的生长、产能提高、品质提高具有显著的作用。钾元素虽然不直接构成生物大分子，但是对植物体内酶的激活有重要作用，且能够促进植物光合作用，是不可缺少的必需元素之一。目前，国内外学者在氮磷钾施肥上做了大量研究，主要集中在肥料配比、生理生化、生长发育形态等三个方面。任开磊等[15]研究发现，氮磷钾肥配比为40:10:100 时，对辣木的生长和产量提高有显著影响。Nestby 等[16]通过给蓝莓对比施肥发现，氮肥和磷肥配合使用比单独施用其中一种肥料更利于产量提高。杨晓清等[17]通过土沉香水分胁迫试验发现，正常水分供应下，施加适量氮肥利于提高幼苗抗氧化酶活性；水分胁迫下，随着施氮量的增加，过氧化氢酶活性显著增加，过氧化物酶活性无明显变化。李桃桢[18]在研究配比施肥对刨花润楠幼林的影响时发现，施肥处理后叶片的生理指标及光合指标相对不施肥均有提高。Maka 等[19]对长叶松对比施肥发现，氮磷钾配比施肥比单一施用氮肥显著提高了幼苗的鲜质量和造林成活率，且氮肥和磷肥配施可以增加幼苗高度。当植物面对各种逆境胁迫时，通过生理生化过程对逆境产生一些适应性反应[20]。研究表明，适量施肥可降低多种作物的细胞膜透性，提高叶片中过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）的活性[21]。

本研究结果显示，除了MDA 之外，其余测定指标在施肥处理条件下的值均高于不施肥处理（N0P0K0），说明施肥总体上可以提高与云南蓝果树幼苗抗旱性有关的SP、CAT、POD、SOD、Pro等生理生化指标含量，并降低MDA 的积累，而这些指标的变化意味着增强了其幼苗的抗旱性。

植物体内的可溶性蛋白（SP）作为植物体中重要的生理生化指标，其含量和施肥量密切相关[14,22]。有研究显示，植物体内可溶性蛋白（SP）含量的积累是有一定阈值的，其含量升高到达一定限度后，就开始降低[23]。在施用不同氮磷钾肥处理时，云南蓝果树幼苗叶片SP 含量随着施肥量的增加表现为先增加后降低，证明了云南蓝果树幼苗细胞在适量施肥时会产生大量的可溶性蛋白来抵御外界的环境变化，保护幼苗减少受伤害，而当氮磷钾肥施用过量时，将会影响植物体内酶的产生，从而严重减少SP 的合成，对植物产生有害作用。施肥处理下的整体表现为：不施肥（N0P0K0）＜缺氮（N0P2K2）＜缺钾（N2P2K0）＜缺磷（N2P0K2），说明云南蓝果树幼苗SP 含量对氮肥的依赖性最强，其次是钾肥和磷肥。氮磷钾配施时，N2P2K1水平下的值最高。

丙二醛（MDA）是细胞受到胁迫后细胞膜过氧化作用分解的最终产物，膜脂过氧化最重要的产物之一，是植物的抗逆性指标，含量越多说明植物受到的活性氧毒害越严重[24]。配比施肥合理时，植物叶片丙二醛含量会逐渐减少[25-27]。试验结果中，对照组（不施肥）处理叶片中的MDA 含量最高；N2P2K1施肥水平时，植物叶片中的MDA含量最低。当施肥浓度及配比高于或低于植物最佳施肥量时，叶片细胞膜通透性增大，MDA 含量增加。同样地，MDA 对氮磷钾肥的依赖程度类似于SP 含量。

超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）是植物细胞中主要承担清除活性氧的保护酶，在逆境下维持其较高的生物活性，能够使植物表现出较强的抗性[7]。研究表明SOD、POD 和CAT 酶活性的高低是植物抗旱性的重要标志[6,28]。游离脯氨酸（Pro）是植物体内渗透压调节物质[29]。试验结果显示，施肥处理的植物叶片SOD、POD、CAT 酶活性和Pro 含量均高于不施肥处理，各组之间差异显著，且随着施肥量的增加，测定指标含量表现为先增加后降低，氮磷钾配比适量施肥（N2P2K1）时最高，表明适量施肥可以促进云南蓝果树呈现最优的生理生化变化。

前期研究发现，云南蓝果树幼苗抗旱性较差是导致其天然更新困难的原因[30]。水分胁迫条件下，云南蓝果树叶片的SOD、POD、CAT 活性、Pro、可溶性糖含量显著降低，而MDA 含量显著升高[6]。本试验结果发现，适量施肥可提高植物本身的抗旱性生理指标，进而间接地增强其抗旱性，促进天然更新。本试验首次采用农业部推荐的“3414”施肥方法对云南蓝果树苗木培育技术开展研究。本试验设计可以将试验结果用函数拟合，推算出最佳施肥量。本研究通过拟合一元二次方程，得出当施氮、磷、钾肥量分别为5.28、0.99和2.97 g/株时，可以保证云南蓝果树的生理指标最佳，为云南蓝果树苗木培育提供了理论依据。然而，氮磷钾肥三者不仅在云南蓝果树幼苗的各项生理指标中发挥着各自的作用，同时，氮磷钾肥效的发挥还受三者彼此间互作的影响。本研究结果显示，中磷低钾（P2K1）水平更利于氮肥效果的发挥，中氮低钾（N2K1）水平利于磷肥效果的发挥，中氮中磷（N2P2）水平有利于钾肥效果的发挥。