鄂铭 刘丽静 郝陶光 焦阳 邢红瑜

摘 要：目的：建立一种快速的、可同时测定水果中多种农药残留量的高通量检测方法。方法：利用QuEChERS样品处理技术，以四极杆傅里叶变换静电场轨道阱高分辨液质联用仪进行筛查和定量。结果：35种常见农药用外标法定量，重复性相对标准偏差、线性关系的范围、回收率和检出限均获得满意结果。结论：本方法简便、灵敏、重现性好、干扰少、特异性好，能满足多种水果中农药残留的高通量检测。

关键词：水果;多种农药残留;快速;高通量

分类号：TS255.7

水果是我们日常生活中不可缺少的食物，我们从水果中摄取多种营养成分。果树在种植和生长过程中不可避免地会被喷洒农药，由于喷洒剂量不尽均匀、降解过程不受人工控制以及成长周期、日照程度、雨水和土壤等诸多原因，水果在成熟之际依然会或多或少地残留一些农药，如果较多的农药残留来到我们的餐桌，经过日积月累地食用，必将危害我们的身体健康。

中华人民共和国国家标准《GB 2763-2016 食品安全國家标准 食品中农药最大残留限量》已于2017年实施[1]，涉及的农药有417种，其中对于常见水果中多种农药的最大残留限量都有着明确规定。如何尽快并准确地判定各种农药在水果中的残留量是否符合国家标准，这必然需要一种快速的、可同时测定多种农药残留量的检测方法，因此本研究拟建立一种检测结果准确的高通量快速检测方法，以此为相关职能部门提供工作依据，进而保证我们的日常饮食安全。

四极杆傅里叶变换静电场轨道阱高分辨液质联用仪（以下简称Q-E）具有通过精确质量数（全扫描质量精度可小于3ppm）准确鉴定化合物的特点，具有超高的选择性和灵敏度，检测速度快，可大大缩短检测周期;而逐渐兴起的QuEChERS技术将样品处理过程进行了大幅简化，从而实现高效。近几年，利用Q-E进行快速检测多种化合物的文章有过多次报道[2，3]，内容涉及农产品中的农药残留、葡萄酒中的农药残留、土壤中的农药残留、保健品中的化学成分以及动物源性产品中的兽药残留等，但仅针对水果中的多种农药残留的检测方法鲜有报道。由于水果种类繁多，成分千差万别，带来的干扰物质多种多样，因此在样品处理方法和仪器分析条件等方面还有很大的提升空间，本研究期望优化后的检测条件将在高通量快速测定的基础上进一步保证定性和定量结果的准确性。

一、材料与方法

1.试剂与材料

（1）标准物质

甲霜灵、多菌灵、苯醚甲环唑、吡唑醚菌酯、毒死蜱标准溶液、戊唑醇标准溶液 、甲硫威、啶虫脒、啶酰菌胺、噻嗪酮、嘧霉胺、肟菌酯、己唑醇、咪鲜胺、螺虫乙酯、噻菌灵、灭锈胺、嘧菌酯、多效唑、螺螨酯，唑螨酯，丙溴磷，甲基嘧啶磷，克百威，烯酰吗啉，霜霉威，噻螨酮，腈菌唑，嘧菌环胺，丙环唑，哒螨灵，上述标准品均为100μg/mL，农业部环境保护科研监测所;乙螨唑标准溶液SPLPD096 （100μg/mL，上海市农药研究所）;抑霉唑（spirotetramat）标准溶液1ST20364，（100μg/mL，美国A chemtek公司）;粉唑醇（flutriafol）标准溶液1ST21178，（100μg/mL，美国A chemtek公司）;乙嘧酚（ethirimol）标准溶液1ST21158，（100μg/mL，美国A chemtek公司）;上述标准物质在使用时均用乙腈稀释为各自的标准工作溶液并配制成混合标准工作溶液。

（2）试剂

甲醇（HPLC级，德国Merck公司）;乙腈（HPLC级，德国Merck公司）;甲酸铵（HPLC级，CNW公司）;甲酸（HPLC级，CNW公司）;乙酸（分析纯，SIGMAALDRICH公司）;水（来自MilliQ超纯水制备系统）。

（3）其他材料

提取剂预混包A（美国安捷伦公司Part No.：59825755）;净化预混离心管B（美国安捷伦公司Part No.：59825058）。

2 仪器及实验条件

（1）仪器

四极杆傅里叶变换静电场轨道阱高分辨液质联用仪Q Exactive，美国Thermo fisher公司;高效液相色谱仪Ultimate 3000，美国Thermo fisher公司;涡旋振荡器400W，美国Fisher Scientific公司;离心机3-16KL，德国SIGMA公司。

（2）色谱条件

色谱柱：Accucore aQ（长度150mm，内径2.1mm，粒径2.6μm）;柱温：恒定25℃;

进样量：2μL;

流动相A：5mM甲酸铵及0.1%甲酸的甲醇溶液+5mM甲酸铵及0.1%甲酸的水溶液（98+2）;

流动相B;5mM甲酸铵及0.1%甲酸的水溶液+5mM甲酸铵及0.1%甲酸的甲醇溶液（98+2）;

梯度洗脱条件见表1。

（3）质谱条件

选择可加热的电喷雾离子源作为电离源，采用一级全扫描和数据依赖的二级扫描同时扫描的方式对水果中的农药残留进行定性筛查，优化各级扫描的分辨率、最大注入时间、AGC离子数、碰撞能量以及关于触发扫描和采集的相关参数，以提高检测多种农残的兼容性，避免遗漏。优化后的条件参数如下：

HESI polarity：positive（+）;

Spray Voltage：3000V;

Capillary Temperature： 325℃;

Sheath Gas：40;

Aux Gas：10;

Probe Heater Temperature： 350℃;

SLens：60V;

Scan type：Full MS/ddMS2;

Full MS scan range：100.0900.0 m/z;

Resolution：70000 for Full MS，17500 for MS/MS;

AGC Target：1e6 Full MS， 5e5 for MS/MS;

Max IT：200ms for Full MS， 60ms for MS/MS;

Loop count：1;

MSX count：1;

Isolation width：2.0 m/z;

NCE/Stepped NCE：40（50%）;

Apex trigger：2-6s;

Dynamic Exclusion：5.0s。

3.樣品处理

依据GB 2763-2016附录 A的规定进行样品制备，参照AOAC2007.01中QuEChERS处理方法进行样品处理：

a）称取均质后的试样15.0g;

b）加入1%乙酸的乙腈15mL，涡旋混匀;

c）加入硫酸镁6g和乙酸钠1.5g（提取剂预混包A），涡旋混匀后，2500r/min振荡提取10min;

d）9000r/min离心5min，取上清液8mL加入N丙基乙二胺400mg和硫酸镁1200mg（净化预混离心管B），涡旋混匀;

e）9000r/min离心5min，取上清液经0.22μm有机滤膜过滤，供仪器分析。

4 筛查条件

优化积分条件，根据实验条件建立35种农药的标准筛查数据库，其中包含化合物名称、分子式、一级母离子精确质量数、保留时间、二级碎片离子精确质量数等信息，在数据库中依据一级母离子精确质量数、保留时间、二级碎片离子匹配情况和同位素峰匹配度打分等条件进行筛查，尽可能的排除假阳性，筛查方法如下：

General Settings：

Use Matrix Blank：10;

Mass Tolerance：5ppm;

Smoothing Points：11

Chromatogram View Width：2.00 minutes;

Target Screening Settings：

Compound Database：pesticides database;

Peaks Threshold Override：1，000，000;

Peaks S/N Ratio Threshold：500;

Retention Time（Identify）： Window Override：30sec;

Fragment Ions （Confirm）：Min 2 of 5 Fragments;

Isotopic Pattern（Confirm）：Fit Threshold （%）：90。

二、结果与讨论

1.液相色谱条件优化

使用C18、C8和Accucore aQ等色谱柱分离混合标准工作溶液中多种农药，结果表明35种农药在Accucore aQ上出峰时间合理，有较高的响应值、信噪比和良好的峰形。经优化流动相体系和配比等液相色谱条件，尽可能降低基质干扰，保证在相对短的检测时间内实现多种农残同时检测。

用1.0μg/mL和0.2μg/mL的35种农药混合标准工作溶液考察不同流动相对仪器分析结果的影响。a）流动相使用甲醇+水时，峰面积响应值有极大提高，多菌灵的峰形得到改善，霜霉威的峰形略有改善，但抑霉唑的峰产生分叉，两个浓度水平均未筛查到烯酰吗啉、噻螨酮、甲硫威和螺螨酯4种农药。b）使用0.1%甲酸的甲醇+0.1%甲酸水溶液时，峰面积响应值略有变化，多菌灵变成肩峰，但两个浓度水平均未筛查到甲硫威和螺螨酯，0.2μg/mL浓度未筛查到烯酰吗啉和噻螨酮。c）使用5mM甲酸铵的甲醇溶液+5mM甲酸铵的水溶液时，峰面积响应值无明显变化，多菌灵和霜霉威的峰形有所改善，但多种农药的同位素匹配度打分值降低。d）使用5mM甲酸铵及0.1%甲酸的甲醇溶液+5mM甲酸铵及0.1%甲酸的水溶液时峰面积响应值和峰形无明显差别，但某些农药的同位素匹配度打分值降低。因此，综合考虑仪器灵敏度和样品基质等因素，采用A和B做流动相。经优化得到表1所述梯度洗脱条件。

2.样品处理条件优化

样品处理采用QuEChERS处理技术，用有机物体系提取水果中的农药残留，分散固相萃取法进行脱水、去色素和净化，尝试优化提取试剂、分散固相萃试剂和净化试剂的用量;针对水果样品的粘度差别细化提取方案，根据含有色素情况提出个性化净化方案。

在草莓中添加0.2mg/kg水平的35种农药，分别用甲醇、丙酮、石油醚、二氯甲烷、正己烷和乙酸乙酯等多种有机试剂提取，考察回收率。用甲醇提取时，硫酸镁和乙酸钠无法使水果中的水和甲醇分层，得到粘稠的提取液，试验终止。用石油醚和正己烷提取时多种农药回收率偏低，甚至很低，其中啶虫脒分别为6.9%和7.7%，噻菌灵为29.4%和33.0%，啶酰菌胺为0.0%和49.8%，多效唑为59.3%和57.2%，嘧菌酯为48.9%和51.6%。使用乙酸乙酯提取时有些农药的回收率不理想，例如霜霉威的回收率为0.0%，嘧霉胺为130.7%。使用丙酮和二氯甲烷提取时回收率均比较合理，未发现明显异常。

同样在草莓中添加0.2mg/kg水平的35种农药，分别用乙腈、含1%乙酸的乙腈、含3%乙酸的乙腈和含5%乙酸的乙腈提取，考察回收率。回收率均比较合理，未发现明显异常。使用乙腈和含5%乙酸的乙腈提取时较1%乙酸的乙腈和3%乙酸的乙腈提取唑螨酯和螺螨酯的回收率有很大提高。

针对水果样品分散固相萃取后，在凈化剂N丙基乙二胺400mg和硫酸镁1200mg中尝试加入超量50%的提取液考察净化效果，分别加入12mL草莓和12mL桑葚提取液进行净化，回收率均比较合理，同加入8mL提取液净化的结果无明显差别，说明此净化剂具有足够去除杂质的能力，降低基质干扰。

由于本研究仅对草莓这一种基质考察了样品处理条件，仅考察了35种农药，因此综合考虑多种因素，暂时采用上述样品处理方法。针对含脂和蜡状水果和适当加入C18EC材料提高净化效果，针对色素丰富的水果可加入 GCB粉末净化，本研究所涉及的29种水果和35种农药在未使用此两种材料的情况下依然取得良好的净化效果。

3.精密度

分别将1.0μg/mL、0.2μg/mL和0.05μg/mL的35种农药混合标准工作溶液连续重复进样10次，再将一份1.0mg/kg添加水平的草莓样品和一份柠檬样品连续重复进样10次，计算农药的保留时间和峰面积的相对标准偏差RSD%。

标准工作溶液中农药的保留时间RSD%在0.11%0.36%之间，峰面积RSD%在0.64%9.55%之间;草莓和柠檬样品中农药的保留时间RSD%在0.13%0.35%之间，峰面积RSD%在0.74%10.5%之间。

4.回收率

分别向草莓、桑葚和苹果中添加1.0mg/kg、0.2mg/kg和0.05mg/kg水平的35种农药，回收率结果见表4。回收率结果在62.9%139.5%之间，添加0.05mg/kg水平的啶虫脒、噻螨酮和噻菌灵未筛查到。

5.筛查结果

依据本研究建立的检测方法对本地市场2020年春季和夏季销售的六大类别29种水果共计86份样品进行了农药筛查和定量。总计筛查到各种农药残留199次，其中，在沙糖桔A样品中检测到0.422 mg/kg的苯醚甲环唑和0.656 mg/kg的丙溴磷，在丑桔B样品中检测到0.367mg/kg的丙溴磷，在丑桔C样品中检测到0.523mg/kg的苯醚甲环唑，均超过国家限量，其他水果中的农药残留均符合国家规定，或暂无规定。同时将筛查到的水果中农药残留量结果同气相色谱—质谱联用仪和液相色谱—质谱联用仪等仪器的定量结果进行比对，基本符合。

此外，本研究还进行了其他相关实验，实验结果表明柑橘类和火龙果等带皮水果在去皮后的果肉中农药残留量明显减少;苹果肉中的农药残留量少于苹果皮中的农药残留量;草莓柄中的农药种类和含量要远高于草莓果肉;煮制加工后很多农药残留量并不会减少;浸泡和清洗会有效降低农药残留量。相关研究结果可以引导百姓合理消费和科学食用水果[4，5]。

四、总结

本研究着眼于国内市场，建立起一种快速的、可同时测定水果中多种农药残留量的高通量检测方法。针对常见的35种农药进行精密度、线性关系、回收率和检出限等技术要求的验证，取得令人满意的结果，基本满足国家对食品理化检测的相关要求。针对糖分高、蛋白含量高、色素丰富等不同类型水果建立普遍适用的样品处理方案和仪器分析条件。

本方法简便、灵敏、重现性好、干扰少、特异性好，能满足多种水果中农药残留的高通量检测。该方法筛查1份水果样本中35种农药残留的整个过程仅用时2小时，将检测成本降低到传统方法的30%，同时缩短了50%的检测时间。在样品检测量大和突发食品安全事件等情况下将大大缩短检测周期，提高工作效率，有效服务于政府执法把关和百姓饮食健康。

参考文献：

[1]夏曦，李晓薇，丁双阳，等.液相色谱-高分辨质谱在兽药残留分析中的应用进展[J].质谱学报，2011，32（6）：333-340.

[2]陈达炜，高洁，吕冰，等.超高效液相色谱-高分辨质谱法快速筛查土豆中的多种农药残留[J].分析化学，2014，42（4）：579-584.

[3]曹新悦.GC-QTOF/MS和GC-MS/MS对果蔬中208种农药残留复查确证能力对比的研究[D].山东：山东农业大学，2015.

[4]苏敏，李世雨，李锋格，等.超高效液相色谱-串联质谱法快速检测番茄酱中吡虫啉等6种农药残留[J].色谱，2011，29（11）：1070-1075.

[5]储大可.植物性食品中农药残留的高通量检测技术研究与应用[D].广东：广东药学院，2015.

2441501705202