张 培，侯云龙，苏 敏，孙 利，徐登封，宋 涛，周璐恒，赵韶华*

(1.承德医学院 中药研究所，河北 承德 067000； 2．石家庄市第二医院，河北 石家庄 050051；3．石家庄以岭药业股份有限公司，河北 石家庄 050035)

当归(Angelicasinensis(Oliv.) Diels)是伞形科多年生草本植物，其干燥的贮藏根是我国传统的大宗药材之一[1]，具有悠久的药用历史，在方剂中的应用甚广，具有平喘、保肝、抗胃肠功能障碍，促进造血等药理作用[2-4]。阿魏酸是当归的主要药效成分之一，毒副作用小，其衍生物常用于抗癌药物、食品、化妆品等原料[5]。阿魏酸又是当归的代谢产物，主要生物合成途径之一是咖啡酸甲基转移酶途径[6]，这个反应由苯丙氨酸解氨酶催化苯丙氨酸生成反式-肉桂酸开始，再由肉桂酸-4-羟基化酶催化反式-肉桂酸生成对-香豆酸，经香豆酸-3-羟基化酶催化作用生成咖啡酸，并以甲硫氨酸作为甲基供体，在咖啡酸-O-甲基转移酶(Caffeic acid o-methyltransferase，COMT)的催化作用下生成阿魏酸[7]。其中，COMT作为一种重要的甲基化酶，可催化咖啡酸生成阿魏酸，且COMT的基因表达和酶活性的改变会直接或间接影响木质素类、苯酞类、香豆素类、黄酮类、有机酸类等代谢产物的生成[8]。因此，COMT可能在促进当归的生长发育及适应环境和阿魏酸的合成过程中起着关键作用。

通过大肠杆菌原核表达系统合成异源蛋白，可以方便研究植物中目标蛋白的生物学功能和酶学特性[9]。原核表达系统具有产量高、易操作和廉价等优点[10]，为研究当归AsCOMT蛋白的表达提供了有效工具。无缝克隆作为一种新兴的DNA克隆技术能快速实现片段与片段或片段与载体的无缝连接，不受酶切位点的限制，也不需要单独的连接反应，可广泛应用在多片段重组和重组表达载体的构建中[11]。……