陈铁楼,许 兵，郭梓琰, 张新海,马丽婷, 王世锋,陈 骏,刘 进 ,方以群

糖尿病型牙周炎(diabetes-associated periodontitis, DAP)患者因血糖升高和糖耐量降低引起机体抵抗力降低，易诱发牙龈炎症、牙槽骨吸收和组织愈合减慢[1-2]。研究发现，糖尿病患者发生牙周炎的危险性比非糖尿病患者明显增高，牙周炎患者凋亡相关蛋白表达增高，可影响胰岛细胞凋亡及其分泌功能。老年牙周炎患者牙龈组织中凋亡细胞数量增加[3]。白细胞介素1β(IL-1β)可刺激人牙周韧带细胞中胶原酶合成，诱导基质金属蛋白酶13表达，调控人成骨细胞扩增和凋亡[4]。我们以往研究发现，DAP患者牙龈组织中IL-1β和肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量高于健康组，牙龈细胞凋亡明显增加[5]。高压氧(hyperbaric oxygen,HBO)可对人牙周炎起治疗作用[6]，但HBO对DAP患者牙龈细胞凋亡和凋亡因子表达及机制罕见报道，本研究拟探讨HBO对DAP患者牙龈细胞凋亡及与IL-1β、TNF-α、前列腺素E2(PGE2)、Caspase3表达的关系，为用HBO治疗DAP及机制研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 病例选择

1.2 主要试剂

TNF-α抗体(北京华夏远洋科技有限公司)，IL-1β抗体(上海阳光生物科研网)，PGE2 抗体(上海基免实业有限公司)，兔抗Caspase3抗体 (南京凯基生物科技有限公司)。免疫组化(IHC)SABC试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，DAB显色剂(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.3 指标测定

1.3.1 临床指标测定 每例患者选10颗牙(包括上颌和下颌切牙各2颗，前磨牙各1颗，磨牙各2颗)，于初诊和治疗1个月后，分别测定各组患者龈沟出血指数(SBI)和牙松动度，按Loe标准测定菌斑指数(PLI)、牙龈指数(GI)，用标准刻度探针测定每个牙的牙周袋深度(PD)和附着丧失(AL)，PD和AL取测定牙颊侧近中、中央、远中和舌侧中央4点的平均值。

1.3.2 HE染色和TUNNEL法检测细胞凋亡[5]在临床指标后，每组在治疗前和治疗后1个月各选择符合拔牙适应证的2例松动牙，拔除时在其舌侧取牙龈组织，一部分立即放入4%甲醛中固定，待行HE、TUNNEL和IHC染色；另一部分用4%多聚甲醛固定制作透射电镜标本。

取经4%甲醛固定24 h牙龈组织，石蜡包埋，切5 μm切片。①HE染色观察牙龈上皮和固有层细胞凋亡；②TUNNEL染色观察细胞凋亡情况，细胞凋亡阳性染色为棕黄色或褐色。高倍镜(40倍)下，用10×10网格分别对视野下的牙龈上皮层阳性细胞和细胞总数计数，每张切片观察10个视野，计算基底层和棘层细胞凋亡指数(AI)=阳性细胞数÷细胞总数×100%。

1.3.3 透射电镜观察细胞凋亡[5]将4%多聚甲醛固定的牙龈组织脱水和树脂包埋，常规超薄切片，醋酸铀、枸橼酸铅染色，透射电镜观察。

1.3.4 IHC测定牙龈组织中TNF-α、IL-1β、PGE2及Caspase3表达[5]对经包埋的牙龈组织，5 μm连续切片,脱蜡,3%过氧化氢孵育，滴加山羊血清封闭非特异性抗体，加一抗(1∶100)，4 ℃冰箱过夜。滴加生物素标记二抗、辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温孵育各15 min。DAB显色，苏木素复染，固定封片。以PBS代替一抗做阴性对照,阳性细胞染为黄褐色。在显微镜( ×200)下用图像分析系统测量阳性染色的吸光度值，每张切片选择10个染色阳性视野测定TNF-α、IL-1β、PGE2及Caspase3含量，计算其均值。

1.4 统计学方法

用SPSS 16.0软件进行统计学分析，采用t检验和方差分析比较治疗前与治疗后1个月时每两组间PLI、GI、SBI、PD、AL差异，及牙龈中TNF-α、IL-1β、PGE2、Caspase3表达量的差异，两组间凋亡细胞阳性表达指数的差异采用χ2检验，P<0.05为有统计学意义。

2 结 果

2.1 HBO对牙周临床指标影响

3组在治疗后1个月时SBI、GI、PD与治疗前比均有显著性差异，治疗后1个月时HBO+SRP组的SBI、GI、PD、AL比HBO组和SRP组明显降低；治疗后1个月时SRP组和HBO+SRP组PLI比治疗前明显降低(表1)。

表1 3组在治疗前、治疗后1个月时SBI、GI、PLI、PD、AL比较Tab.1 Comparison of SBI, GI, PLI, PD, AL between the 3 groups before and 1 month after treatment

2.2 HE染色结果

HBO组在治疗后1个月时牙龈上皮层基底细胞和棘细胞凋亡比治疗前明显减少，固有层巨噬细胞和淋巴细胞减少，血管明显增多；SRP组牙龈组织细胞凋亡减少，血管数量增加不明显；HBO+SRP组在治疗后1个月时细胞凋亡数量比HBO组和SRP组减少，凋亡程度减轻，血管数量明显增加(图1 A～C)。

A：HBO组治疗前； B：HBO组治疗后1个月； C：HBO+SRP组治疗后1个月; 凋亡细胞()；红细胞(★)；血管(▲)

2.3 TUNNEL结果

HBO组和SRP组在治疗后1个月时阳性细胞数量比治疗前明显减少，凋亡细胞位于基底细胞层和棘细胞层，染色为阳性；HBO+SRP组牙龈上皮层和固有层凋亡细胞数量比HBO组和SRP组明显减少，凋亡细胞呈阳性或弱阳性(图2)。HBO+SRP组基底细胞和棘细胞的凋亡细胞指数比HBO组和SRP组明显减少(表2)。

A：SRP组; B：HBO组治疗前; C：HBO组治疗后1个月；D：HBO+SRP组治疗后1个月；凋亡细胞()

表2 3组治疗前、治疗后1个月时牙龈上皮层和固有层凋亡细胞阳性表达指数比较Tab.2 Comparison of positive expression index of apoptosis cell in basal cell and acanthocyte between 3 groups before and 1 month after treatment %

2.4 超微结构变化

DAP患者在HBO治疗前凋亡细胞核固缩，与胞质分离出现间隙，内质网疏松形成空泡，胞质浓缩，线粒体肿胀，可见胞膜内陷形成凋亡小体。HBO组和SRP组在治疗后1个月时细胞凋亡数量和凋亡程度明显减轻，HBO+SRP组细胞凋亡的核固缩程度明显减轻，胶原纤维排列整齐，成纤维细胞内线粒体未见明显水肿，凋亡小体少见(图3)。

2.5 HBO对牙龈组织TNF-α、IL-1β、PGE2和Caspase3表达影响

DAP患者在HBO治疗前牙龈固有层TNF-α、IL-1β、PGE2染色呈强阳性，主要阳性细胞为巨噬细胞和淋巴细胞,基底细胞呈弱阳性；牙龈上皮和固有层Caspase3呈强阳性，主要阳性细胞为上皮基底细胞和棘细胞，巨噬细胞和淋巴细胞呈弱阳性。HBO组和SRP组在治疗后1个月时TNF-α、IL-1β、PGE2、Caspase3 阳性细胞数量和染色强度减轻；HBO+SRP组固有层染色阳性细胞数量和程度比HBO组和SRP组明显减轻(图4)。根据Lamber-Beer定律，组织中TNF-α、IL-1β、PGE2、Caspase3 含量与吸光度值成正比，可用吸光度值来反映，治疗后1个月时3组的牙龈组织中TNF-α、IL-1β、PGE2、Caspase3值与治疗前有显著性差异，HBO+SRP组治疗后1个月时TNF-α、IL-1β、PGE2、Caspase3 值明显小于HBO组和SRP组(表3)。

表3 3组治疗前、治疗后1个月时牙龈组织中TNF-α、IL-1β、PGE2、Caspase3吸光度值比较Tab.3 Comparison of absorbency of TNF-α, IL-1β, PGE2 and Caspase3 in gingival between 3 groups before and 1 month after treatment

A：HBO组治疗前； B：HBO组治疗后1个月； C：HBO+SRP组治疗后1个月；凋亡细胞核固缩 (); 线粒体(▲); 纤维(★)

3 讨 论

糖尿病与牙周炎存在双向关系，DAP与牙龈细胞凋亡密切相关。研究发现，细胞凋亡表现为细胞核固缩及蛋白降解，牙周致病性的伴放线聚集杆菌和牙龈卟啉单胞菌可诱导牙龈上皮细胞和成纤维细胞凋亡[8]。Alikhani等[9]报道，细菌脂多糖在TNF-α作用下可增加凋亡因子Caspase8活性，促进成纤维细胞凋亡；牙龈卟啉单胞菌侵入牙龈上皮2 h，可促进Bax蛋白表达增强。糖尿病的高血糖可增加促凋亡基因Caspase 活性和mRNA水平，促进成纤维细胞和成骨细胞凋亡[10]，影响伤口愈合和组织修复。本研究发现，DAP患者牙龈上皮层基底细胞和棘细胞凋亡，凋亡细胞体积变小，线粒体肿胀，胞膜内陷，核染色体固缩。

牙周厌氧菌能激活人单核细胞产生IL-1β，刺激成纤维细胞产生胶原酶和PGE2，诱导骨吸收。炎症时多型核白细胞浸润,释放TNF-α和IL-1β，诱发炎症反应。糖尿病患者高血糖可诱导活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)直接损伤牙周组织或通过影响胰岛b细胞,激活氧化应激敏感信号通路,包括NF-kB、蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)等,导致TNF-α等炎性因子产生，激活胶原酶和破骨细胞引起牙周组织破坏[11]。DAP由于长期高血糖导致高级糖基化终产物增加，通过丝裂原活化蛋白激酶刺激细胞凋亡与细胞表面受体结合导致TNF-α、IL-1β和PGE2分泌，促进成纤维细胞凋亡，影响牙周组织修复[12]。本研究发现DAP患者牙龈组织中IL-1β、TNF-α和PGE2表达量升高，与患者SBI、GI、PD和AL增加和细胞凋亡程度正相关。

Zhou等[13]发现HBO联合促红细胞生成素可抑制脊髓损伤大鼠神经元凋亡，促进其损伤修复。HBO暴露可防止蛛网膜下腔出血引起的兔膀胱细胞凋亡和收缩能力受损[14]，HBO可上调BDNF/TrkB信号通路，通过抗凋亡和抑制树突状/突触变性，改善脊髓损伤所致的神经功能障碍[15]。本研究发现HBO组凋亡基因Caspase3表达明显降低，HBO+SRP组对Caspase3作用明显强于HBO组和SRP组。SRP组患者Capsase3降低可能与牙周洁治去除细菌对牙龈细胞刺激，炎症因子分泌减少，促凋亡因子减少，细胞凋亡被抑制有关。

在牙周炎症状态下，免疫细胞活动增强，炎症因子合成和分泌增加，参与牙周组织的破坏。牙周致病菌可通过受损的牙周组织进入血循环，加重糖尿病的发展[16]。2型糖尿病患者龈沟液中的IL-1β、PGE2 水平明显高于非糖尿病患者[17]，而IL-1β、PGE2可刺激DAP骨吸收，诱导蛋白酶产生，抑制胶原和非胶原合成[18]。我们以往发现HBO暴露可抑制牙周袋内厌氧菌繁殖对牙周炎起治疗作用[19]。本研究发现HBO组和SRP组在治疗后1个月时牙龈中TNF-α、IL-1β、PGE2水平明显降低，HBO+SRP组牙龈中IL-1β、TNF-α、PGE2水平降低更明显，且与SBI、GI、PD、AL值及细胞凋亡指标Caspase3表达降低一致，表明HBO可通过抑制牙周炎牙龈组织中IL-1β、TNF-α、PGE2产生，降低Caspase3表达，减少牙龈细胞凋亡，HBO联合SRP对糖尿病型牙周炎IL-1β、TNF-α、PGE2和Caspase3 抑制作用更明显，并可维持1个月以上。有关HBO暴露对糖尿病型牙周炎细胞凋亡的时间效应的影响另文发表。

炎细胞 ()；基底细胞(▲)