殷智宇 阮文晴 孙 龙 魏 盼 宋建钢

上海中医药大学附属曙光医院麻醉科，上海 201203

炎性痛机制复杂，临床治疗棘手且治疗效果欠佳[1]。研究表明，促炎和抗炎细胞因子失衡导致的脊髓神经炎症是慢性痛发生发展的关键原因[2-3]。去氢紫堇碱（dehydrocorydaline，DHC）是中药延胡索中的一种小檗碱单体，动物和细胞学实验均证实，DHC 具有抗炎作用[4-5]。笔者前期研究发现，单次腹腔注射DHC 可在福尔马林疼痛模型中发挥镇痛作用[6]，但DHC 是否通过调控脊髓促炎和抗炎因子的表达缓解脊髓神经炎症，治疗慢性炎性痛尚不清楚。本研究以完全弗氏佐剂（complete Freund’s adjuvant，CFA）诱导的慢性炎性痛小鼠模型为研究基础，观察DHC 是否可以调控脊髓促炎和抗炎细胞因子的表达，缓解小鼠的痛觉过敏。

1 材料与方法

1.1 实验动物

30 只雄性ICR 小鼠，6～8 周，体重28～32 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2015-0001，合格证号：44002100206635。本研究经上海中医药大学附属曙光医院医学伦理委员会批准。

1.2 试剂与仪器

DHC（纯度≥98%，徐州微科曼得生物有限公司，货号：VIC449），CFA（美国Sigma 公司，货号：F5881），肿瘤坏死因子-α（TNF-α）一抗、白细胞介素（IL）-1β一抗、IL-6 一抗、IL-10 一抗（英国Abcam 公司，货号分别为：ab6671、ab2105、ab6672、ab134742），动态足底触觉仪、热辐射刺激仪（意大利UgoBasile 公司，型号：Model 37450、30370）。

1.3 方法

1.3.1 分组与给药 将小鼠按随机数字表法分为三组，每组10 只，分别为Sham 组、CFA 组和CFA+DHC组。造模前测定小鼠基础痛阈值。Sham 组小鼠足跖中部皮下注射25 μL 生理盐水，CFA 组和CFA+DHC 组小鼠足跖中部皮下注射25 μL CFA 建模。小鼠于造模后1～7 d，CFA+DHC 组小鼠每天腹腔注射10 mg/kg DHC（剂量参考本研究前期已发表文章[6]），CFA 组小鼠腹腔注射溶媒（10% DMSO），给药后30 min 进行痛行为学测定。

1.3.2 慢性炎性痛造模 小鼠俯卧位，使用微量注射器在小鼠右后足跖中部皮下注射25 μL CFA[7-8]。

1.3.3 机械痛阈值的测定 使用动态足底触觉仪测量小鼠的机械缩足反射阈值（the paw withdrawal mechanical threshold，PWMT）。将小鼠放入仪器中，适应环境安静后，使用金属线垂直地压向小鼠足底中央表面，压力均匀增加，阳性反应为足退缩或后肢回缩，此时压力值即为PWMT。重复测量3 次，取3 次平均值为PWMT[9]。

1.3.4 热痛阈值的测定 使用热辐射刺激仪测量小鼠的热缩足反射潜伏期（paw withdrawal latency，PWL）。在小鼠适应环境后将光点照射于小鼠足底中部皮肤，阳性反应为下肢出现特征性的回缩或抬起，此时仪器自动切断电源，并显示时间，数值即为PWL。重复测量3 次，取3 次平均值即为PWL[10]。

1.3.5 Western blot 检测小鼠脊髓促炎因子和抗炎因子的表达 造模7 d 后，取小鼠脊髓腰膨大，裂解组织后静置30 min，离心速度12 000 r/min，离心半径15 cm，时间20 min，收集上清液，按BCA 蛋白测定试剂盒（英国Abcam 公司，ab102536）说明确定样本蛋白浓度，于SDS 聚丙烯胺凝胶上恒压电泳，电转至PVFD 膜上，加一抗TNF-α（1∶800）、IL-1β（1∶1000）、IL-6（1∶1000）、IL-10（1∶1000）和β-actin（1∶1000），4℃过夜，PBST 漂洗滤膜，加入二抗孵育2 h，使用ECL 系统检测免疫复合物，Image J 软件分析条带的灰度值。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0 统计学软件对所得数据进行分析，计量资料采用均数±标准差（），采用重复测量的方差分析或单因素方差分析，进一步两两比较采用Bonferroni 法。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 连续腹腔注射DHC 对慢性炎性痛小鼠PWMT 的影响

整体分析发现：组间比较、时间点比较及交互作用差异均有统计学意义（均P ＜0.05）。提示各时间点、各组间的PWMT 均存在差异，且处理因素对PWMT的作用会随着时间的变化而变化。进一步两两比较，组内比较：Sham 组造模前后PWMT 比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。造模后，CFA 组、CFA+DHC 组PWMT 较造模前降低，差异均有统计学意义（均P ＜0.05）。组间比较：造模前，三组PWMT 基础值比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）；造模后1～7 d，与CFA 组比较，CFA+DHC 组PWMT 升高，差异均有统计学意义（均P ＜0.05）。见表1。

表1 连续腹腔注射DHC 对慢性炎性痛小鼠PWMT 的影响（g，）

表1 连续腹腔注射DHC 对慢性炎性痛小鼠PWMT 的影响（g，）

注：与本组造模前比较，aP ＜0.05；与Sham 组同时间点比较，bP ＜0.05；与CFA 组同时间点比较，cP ＜0.05。DHC：去氢紫堇碱；PWMT：机械缩足反射阈值；CFA：完全弗氏佐剂

2.2 连续腹腔注射DHC 对慢性炎性痛小鼠PWL 的影响

整体分析发现：组间比较、时间点比较及交互作用差异均有统计学意义（均P ＜0.05）。提示各时间点、各组间的PWL 均存在差异，且处理因素对PWL 的作用会随着时间的变化而变化。进一步两两比较，组内比较：Sham 组造模前后PWL 比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。造模后，CFA 组、CFA+DHC 组PWL 较造模前缩短，差异均有统计学意义（均P ＜0.05）。组间比较：造模前，三组PWL 基础值比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）；造模后1～7 d，与CFA 组比较，CFA+DHC 组PWL 延长，差异均有统计学意义（均P ＜0.05）。见表2。

2.3 DHC 对慢性炎性痛小鼠脊髓促炎性细胞因子和抗炎细胞因子表达的影响

造模后，与CFA 组比较，CFA+DHC 组脊髓TNF-α、IL-1β、IL-6 蛋白表达均降低，差异均有统计学意义（均P<0.05）；与CFA 组比较，CFA+DHC 组脊髓IL-10蛋白表达增加，差异有统计学意义（P<0.05）。见图1。

表2 连续腹腔注射DHC 对CFA 慢性炎性痛小鼠PWL 的影响（s，）

表2 连续腹腔注射DHC 对CFA 慢性炎性痛小鼠PWL 的影响（s，）

注：与本组造模前比较，aP ＜0.05；与Sham 组同时间点比较，bP ＜0.05；与CFA 组同时间点比较，cP ＜0.05。DHC：去氢紫堇碱；PWL：热缩足反射潜伏期；CFA：完全弗氏佐剂

3 讨论

小鼠足底注射CFA 后可引起明显且持续时间较长的炎性痛，是慢性炎性痛经典模型[11-12]。本研究中，小鼠右后足底皮下注射CFA 后1～7 d 均可观察到显著的痛觉过敏，表现为致炎足PWMT 明显降低、PWL明显缩短，提示造模成功。

DHC 是中药延胡索中的一种活性碱成分[13-14]。分子药理学研究发现，DHC 具有抗炎、抗肿瘤、心血管系统保护等多方面药理作用[15～19]。笔者前期研究发现，单次腹腔注射DHC 可显著缓解小鼠福尔马林炎性痛[6]。但是连续使用DHC 对慢性炎性痛治疗的效果，以往鲜见报道。本研究发现，连续腹腔注射7 d DHC，可显著提高小鼠的PWMT 和PWL，证实了连续使用DHC治疗慢性炎性痛的有效性。

图1 DHC 对慢性炎性痛小鼠脊髓促炎性细胞因子和抗炎细胞因子蛋白表达的影响（n=10）

外周炎性损伤发生后，脊髓水平的炎性细胞因子表达随着损伤时间发生变化，产生中枢敏化，导致慢性炎性痛[20-21]。脊髓神经免疫反应过程中，胶质细胞激活后，释放多种细胞因子，包括促炎性细胞因子（如TNF-α、IL-1β 和IL-6）和抗炎细胞因子（如IL-10），当促炎因子和抗炎因子表达失衡，中枢神经系统免疫应答平衡被打破，则产生脊髓神经炎症，导致慢性炎性痛的发生发展[22～26]。本实验CFA 慢性炎性痛模型小鼠脊髓TNF-α、IL-1β 和IL-6 表达显著增高，IL-10表达显著降低，与行为学痛阈值下降一致，DHC 治疗7 d，可显著降低CFA 小鼠脊髓促炎性细胞因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 蛋白的表达，并增加抗炎细胞因子IL-10蛋白的表达，说明DHC 可通过调节抗炎和促炎性细胞因子的表达发挥镇痛作用。但DHC 具体是通过何种途径调节脊髓促炎和抗炎细胞因子的表达仍需进一步研究。

综上所述，DHC 可缓解CFA 慢性炎性痛小鼠的疼痛，其机制可能与调节脊髓促炎和抗炎细胞因子的表达有关。