◎ 范 蕊，王文文，卢 彬

（新疆维吾尔自治区分析测试研究院，新疆 乌鲁木齐 830011）

食品卫生安全问题是全球各个国家都普遍关注的重要内容，是人们日常生活和社会稳定发展的重要条件，而微生物所造成的食源性疾病则成为影响食品安全卫生的关键一环。

1 食源性致病微生物快速检测技术研究的意义

世界卫生组织在2002年发布的一份报告中表明，全球各国每年发生的食源性疾病达到了数十亿例，即使是发达国家也存在至少35%的居民患有或正在患食源性疾病。绝大多数食源性疾病是由细菌所引发的，食源性致病细菌中，沙门菌、志贺菌、单增李斯特菌和变形杆菌等，都属于较常见的致病菌，这些致病菌往往会引发一些严重的重大事件[1-2]。

在2011年，美国就曾经发生了由单增李斯特菌所引发的食源性疾病事件，从7月末到10月初的短短60多天内，50%以上的自治州共出现了110例食源性病例报告，是近20年美国发生的性质最为严重的一次疾病发作事件[3-4]。食源性疾病在我国也时有发生，几乎每年都有食物中毒、食品卫生事件的报道出现，使消费者对食品制造加工、工农业以及消费品等行业的信心受到了严重的影响。

虽然当前我国在对食源性致病菌的微生物检测检验方面具有成型的常规检测检验方式，但这些方式方法通常都要在实验室内进行，检验过程包含了对致病菌的采集收集、培养克隆、分离观测等环节，不但需要耗费一定的物资和人员精力，而且需要较长的时间周期。再加上我国在相关检测的试剂和器皿等方面无法实现完全配套适应，因此对于公共食品卫生安全事件的快速应急反应处置还无法满足实际需要。

近几年以来，越来越多的研究机构和科研人员意识到了食源性致病菌的快速检测技术研发的重要性。微生物检测最重要的是准确性，虽然快速检测法并不能完全确保检测结果的正确性，但可以通过快速检测法，辨别出符合检测标准的样本，剔除不符合检测检验条件及标准的样本，从而达到提升检测效率的目的。得益于科学水平的进步，快速检验技术水平也得到了较大的提高。

2 常见检测方法与技术

2.1 免疫检测法

2.1.1 酶免疫技术

免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性与酶的高效催化作用有机结合的一种方法。它以酶作为标记物，与相应的抗原或抗体作用后，通过底物的颜色反应进行定性和定量分析，亦可用于组织中抗原或抗体的定位研究。基于酶免疫的检测方法按照抗体与抗原的反应是否需要对游离的酶生物标记部分的不同结果可以分为两种不同的类型，即均相法和非均相法，其中最为常见的是非均相法，其中又包括了固相形态免疫法和非固相形态免疫法。

2.1.2 荧光免疫技术

作为免疫检测技术中最早出现的一种方法，荧光免疫检测法是以生物学、免疫学、化学以及显微镜技术为基础从而建立起来的。科研人员利用微生物抗原抗体分子和示踪物质之间的结合，根据抗原抗体的反应特异性来定位组织细胞的内抗物质。这种技术能够实现对金黄色葡萄球菌、沙门菌以及单增李斯特菌等致病菌的快速检测。

2.1.3 酶联荧光技术

当前食源性致病细菌的测试鉴定技术中采用基础最大的是酶联荧光检测鉴定法，这项技术的原理是充分运用已知抗原体的强吸附性，将其与微生物微量检测反应板中的固体形态载体相连接，固相载体的表面因此产生酶标记物抗原体结合反应，随后再将液相里的游离成分进行洗涤清除。

2.2 生物分子检测法

2.2.1 PCR技术

PCR技术即聚合酶链式反应技术，其特点是反应速度快，可以在较短的时间内将微量样本中的特定片段扩大数百万倍，是当前食品微生物致病菌检测当中较为常见的一项技术，得到了较为广泛的应用。虽然该项技术具有简便、灵活、成本低等特点，但由于市面常见检测方法与之结合程度不高，因此无法实现精确定量检测。

2.2.2 基因芯片技术

分子生物学近年来重大进展之一就是基因芯片技术，该技术是采用杂交序列测试法，把一组已知序列核酸的探针之间进行相互杂交，并进行核酸序列的测试定性。由于该技术能够实现同一时间固定较大数量的核酸探针，因此能够对检测样品的大规模序列进行分析检验，大大改善了传统技术中存在的操作复杂、检测序列数量少、半手动化、工作效率不高等缺陷，在众多检测技术中具有明显的优势。

2.3 传感器检测法

2.3.1 电化学基因传感技术

电化学技术近几年以来在生物核酸传感方面的实践与应用上取得了很大的进展，该项技术的核心是利用电化学的核酸探针能够判断基因是否存在这一特点，通过检测器在特定环境与条件中，对探针发出的不同电极、光源信号变换进行监测和识别，并根据结果来判定靶向生物分子是否存在。由于该技术具有明显的便携性、灵敏性特点，同时兼具低成本、低功率、低消耗优势，再加上其对样品的保护程度高，器具结构微型，在食源性微生物领域的发展前景非常的广阔[5]。

2.3.2 核酸检测微流控技术

核酸检测微流控制技术是将微机械电子系统作为基础，建立微型阀、微型泵、微型控制器和微型传感器等单元结构，实现化学分析检测各环节之间的集约、连续和微型化。该技术最明显的特点是能把控制多种问题检测的技术单元集成在小体积灵活控制且具有规模性的平台中，不但能够大幅度降低人工操作造成的失误与差别，还能有效减少检测时间、压缩检测成本，因此该技术在食源性致病源微生物检测中能够发挥出灵活、简单、便捷的特点。

2.4 DNA探针检测技术

该项技术主要是运用已知序列的DNA片段与未知序列DNA片段之间的杂交，并用特有方式进行探知和标记，具有突出的灵活性和特异性，同时还兼具了化学染色的显性特点和定位性。在技术运用测试实验中，能够对肉毒菌、大肠杆菌、单增李斯特菌和霍乱菌等食源性致病微生菌原体表现出明显的特异性和敏感性，虽然沙门菌与结肠菌等有交叉反应，但对检测结果不构成实质影响。

2.5 阻抗检测法

这是一种利用微生物新陈代谢引发培养基电极特性变动而对检测样品微生物的成分与含量进行检查和测定的方法。检测样品中微生物的新陈代谢能够让培养基中具有惰性的电分子物质转换为具有电活性的小分子物质，例如把脂肪、碳水物等转化为蜡酸盐、氨基酸等物质。在微生物新陈代谢过程中，培养基里的惰性物质被具有活性的电分子取代，提高了培养基的导电性，根据细胞活性判定其是否具有致病性，检验食品中活细胞数量对食品安全检验具有明确的实际意义。

2.6 传感器技术

2.6.1 生物传感器检测法

这种检测法主要是通过生物传感器实现检测功能。生物传感器问世20世纪60年代，在80年代形成一定的规模和固定研究领域，其主要是把固定化的生物敏感材料作为识别元件，再配上恰当的信号传导装置，最终构成检测分析工具。这种工具按照生物元件的不同分为微生物、免疫功能以及酶物质传感器等类型，优点是灵活程度高、检测成本低且器具体积小，能够在腐坏变质或即将腐坏变质的食物中获得迅速、实时以及多种复杂情况的检测分析结果。

2.6.2 免疫传感器检测法

免疫传感器检测法是一种采用新型生物传感器实现免疫检测的方法，该传感器的结构与传统的生物传感器具有高度一致性，其主体结构由数据信息处理单元、生物特性感知单元和换能处理单元组成，与传统技术的区别在于检测样本和传感器识别单元结合之后，产生的物体将生物信号经换能单元变成可被识别的光电信号，尤其是电化学信号的质量好，无论在精确程度、可选范围、存储质量以及信号清晰度方面，都具有明显优势，但是对比我国2010年出台的检测操作规定而言，检测时长最短需达到一周左右，因此不具备实际操作性。

2.7 蛋白质芯片技术

该技术的原理是，通过蛋白质阵列放大食品中所含蛋白质的生物活性，这一技术主要通过蛋白质芯片实现。蛋白质芯片是由数量巨大的蛋白质、生物探测单元、蛋白质活性检测试剂按照设计好的序列排列在固定器皿载体中所形成的阵列或微型阵列，能够提高食品蛋白质活性检测的数量，增加蛋白质与分子之间的相互作用，实现了生物蛋白质活性测试的高通量及定向测量，在食品安全及生命安全等科学领域发展有重大影响作用。

2.8 纳米金检测技术

纳米金技术又可以称为金染色免疫法，出现于20世纪70年代，其标记物体是纳米等级的金质颗粒，纳米金指的是直径在1～100 nm的微小金颗粒，因颗粒的表层具有负极电离子，对静电有明显的排斥作用，在液相中可以长久保持稳定形态，形成稳定的胶体。该物质的特性是高电子密度介电性，同时还有催化功能，在与大多数生物因子结合时候保持原有活性，目前已经在免疫细胞学、生物化学、生物标记技术等方面，在食品安全性检测中发挥了重要作用，是食源性致病菌原体快速检测及微生物研究中常见的技术，适用于多种类型的检测，通过在纳米金颗粒表面标记上特定的寡核苷酸探针以及对纳米金颗粒表面特性的处理，开发出了一系列新的生物检测系统，为分子级别领域实现快捷检测致病微生物提供了技术基础，甚至能够检测出致病源菌的耐药性变异情况，对大肠埃希氏菌、沙门菌、志贺氏菌、霍乱弧菌和副溶血弧菌等具有高灵敏度和特异性[6]。

3 研究现状

我国南京工业大学科研团队于2018年全球首次开发出了基于荧光素酶的系列食源性致病菌快速检测系统，实现了对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌O157、奇异变形杆菌及产气肠杆菌肺炎克雷伯氏杆菌的单独和混合检测，最低检测限达10 CFU，与传统食品菌落检测仪和荧光定量PCR法相比，该系统具有更高的特异性，可以将检测时间缩短至2～3 h，且设备、试剂成本相对较低，与现有系列食源性致病菌检测系统相比，具有极大的竞争优势。细菌的识别检测在疾病防控、临床诊断以及食品卫生安全等领域具有重要研究价值和实用意义，建立快速灵敏的细菌检测新技术和新方法已经成为国内外研究热点。这款食源性致病菌快速检测系统，体现了快速灵敏的细菌检测技术，为实现细菌检测微型化、自动化和实时现场检测提供新途径和广阔前景，对疾病控防、临床诊断以及食品卫生安全等领域具有重要研究价值和实用意义[7]。

2019年初，中国农业大学科研团队利用微流控技术实现食源性致病菌的快速、灵敏检测。微流控技术近年来发展迅速，芯片集成的单元部件越来越多，集成规模也越来越大，同时微流控芯片可以大量平行处理样本，具有高通量、分析速度快、物耗低、污染小的特点，使之为材料学、化学、生命科学和生物医学等领域的基础与应用提供了一个有力的平台。这种新型的食源性致病菌检测技术，先利用同轴通道和二氧化硅磁珠进行DNA提取和富集，再利用融智生物微流控核酸定量分析平台QuanPLEX和微流控芯片进行DNA扩增和检测，可在2 h内检出低至12 CFU·mL-1的大肠杆菌O157∶H7，实现了食源性致病菌的快速、灵敏检测。传统检测技术对PCR技术的依赖程度较高，在市面中常见的常规PCR、免疫PCR、微控PCR、实时PCR及多重PCR等技术中，微控PCR以操作自动化、检测成本低、检测时间快及交叉污染少等特性受到越来越多的关注，因其快捷、高效、灵活等优势，广泛应用在食源性微生物的快速检测领域，但是从复杂食品样本中提取核酸的技术研究却鲜有人关注。这些方法通常操作较复杂、劳动强度较大、耗时较长且存在重现性和毒性试剂等局限性。更重要的是，它们不适用于从大量样本中提取少量靶向DNA。

中国农业大学研究中所用的微流控核酸定量分析平台是融智生物QuanPLEX食品安全微生物快速检测系统。QuanPLEX是一款符合国标的食品微生物快检系统，可同时检测32个指标；检测速度快，比传统qPCR检测速度提高一倍以上；安全性好，封闭式芯片可避免气溶胶污染；极简前处理，一键式操作软件，操作简便。在检测大体积样品中低浓度大肠杆菌O157∶H7中表现出了巨大潜力，将传统的细菌分子生物学检测技术的灵敏度提高了近百倍，有望实现食源性致病菌的现场、快速、多目标检测，切实保障食品安全[8]。

4 展望

目前，传统的食源性病原菌的检测、鉴定仍停留在分离培养、形态观察、生化鉴定和血清学分型水平。这些方法操作烦琐、需要时间较长、准备和收尾工作繁重，检测周期较长，而且无法对难以培养的病原菌进行检测，因此病原微生物的检测结果往往存在不同程度的滞后性。这不仅不利于食品安全管理体系及时验证控制措施实施效果，而且不利于对潜在不安全产品迅速采取纠正和纠正措施。对食源性致病菌进行准确、灵敏、省时、省力和省成本的快速检验方法已经成为保证食品安全的迫切需求[9]。

随着科学技术的发展和人们对食品安全的重视程度的不断增强，食品中致病性病原微生物的快速检测将在食品工业原料质量估测、加工工艺评估、成品质量检测、产品货架期预测等方面得到越来越广泛的应用，在食品安全管理体系的建立和实施中发挥越来越重要的作用。这些快速检测技术的推广应用，不仅是对传统的食品安全检测技术的一个改进和提高，也使食品质量安全有了进一步的保证，从而推动食品工业更加健康、快速向前发展，改变人类的生活质量，满足人民提高健康水平的需要。我国采用的大多数是国外的快速检测技术，检测成本高，缺乏相应国家标准。在以后的工作中，应采取多种方法，引进、消化国外的先进技术，生产出我国自己的快速检测产品。同时积极组织研究所、大专院校和企业的专家建立国家标准和规范，推动我国快速检测技术的发展[10]。