毕金龙，梁正基，张险峰，杨青，王鹤菲，潘鑫悦，秦美琼，王志兵

（1.长春工业大学化学与生命科学学院，吉林长春 130012）（2.吉林省产品质量监督检验院，吉林长春 130012）

五味子为木兰科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.或华中五味子Schisandra sphenantheraRehd. et Wils.的干燥成熟果实[1]，最早记于《神农本草经》，是一种著名的传统中药，具有保护中枢神经系统、保护肝脏肾脏[2,3]、清除体内自由基[4]、镇咳[5]、祛痰、抗肿瘤[6]、抗HIV[7]等作用，常用于治疗慢性肝炎[2,3]、无黄疸型传染性肝炎、心脑血管疾病[8]、肺纤维化[9]以及小儿肺炎[10]等症。五味子果实中含有丰富挥发油、木脂素、有机酸、维生素C、树脂、鞣质及少量糖类等。其中，木脂素类化合物是五味子中的主要药理活性成分，在植物体内多数呈游离状态，少数与糖结合成苷而存在于植物的根部和树脂中。随着现代分离手段、结构鉴定方法及高通量筛选技术的广泛应用，越来越多的木脂素类化合物及其生物活性被相继报道[11]。

目前，常用的五味子中木脂素类化合物的检测方法有紫外分光光度法[12]、液相色谱法[13-15]、液相色谱-质谱联用法[16,17]和毛细管电泳法[18]等。高效液相色谱法具有分离效率高，选择性好，检测灵敏度高，操作自动化等优点，现已被广泛应用。因此，本实验选择高效液相色谱法对目标分析物进行分离检测。目前，较常用的五味子木脂素类成分的提取方法有溶剂浸渍法、渗漉法、煎煮法[19]、热回流提取法[20]、双水相萃取法[21,22]、超声波提取法[19]和微波提取法[23,24]等。传统的热回流法、浸渍法、煎煮法及渗漉法是常用的工业化提取方法，吴艳玲等[20]采用乙醇回流法对五味子中的木脂素类化合物进行提取，使用6倍量的95%乙醇，加热回流提取2次，每次2 h，总木脂素得率为7.23 mg/g，同时，又采用渗漉法对五味子中木脂素类化合物进行提取，以95%乙醇浸泡24 h后，以10 mL/min的流速，共接收10倍量体积的渗漉液，最后总木脂素得率为10.95 mg/g。虽然这些方法操作简单，提取率高，但是有机溶剂用量大，且提取时间较长，提取效率低。超声波提取法、双水相萃取法和微波提取法是近二十年来开发应用的新方法。赵大伟等[23]采用微波辅助提取法对五味子中木脂素类化合物进行提取，通过四因素、三水平的Box-Benhnken设计优化得到最佳微波提取工艺为乙醇浓度84%，料液比为1:15，提取次数为2次，提取功率为800 W，总木脂素得率为7.88 mg/g。胡佳等[22]采用硫酸铵—乙醇双水相法提取南五味子木脂素，最优条件为：醇浓度26.07%、盐浓度24.81%、超声时间10.28 min，在最佳条件下，五味子甲素的萃取率可达到98.48%。虽然上述方法操作简单快速，提取时间短，但是有些方法需要使用大量有机溶剂，且样品处理量小，只适用于实验室分析。双水相萃取法虽具有易操作、成本低、产量大等优点，近年来备受关注并广泛使用，但受溶剂种类、溶剂用量和目标物性质等因素影响，部分木脂素类化合物的萃取率并不理想。

超临界流体萃取法是近年来发展起来的中药活性成分提取的常用方法[25-27]，它是利用超临界状态的CO2作为萃取溶剂，通过改变萃取条件来获得较高的提取效率。目前，超临界流体萃取法已在挥发油、多酚、香豆素、鞣质以及木脂素等物质的萃取方面有着广泛的应用。崔敬爱等[28]利用超临界萃取法对北五味子中木脂素类化合物进行提取，萃取条件为原料粒度0.18～0.25 mm，投料量每罐300 g，萃取压力30 MPa，萃取温度45 ℃，萃取时间120 min，CO2流量15 L/h，最终获得五味子木脂素的得率为1.024%；程敏等[29]利用超临界萃取法对南五味子中木脂素类化合物进行提取，萃取条件为原料粒度0.425 mm，投料量每罐100 g，萃取压力20 MPa，萃取温度35 ℃，萃取时间120 min，CO2流量20 mL/min，最终五味子木脂素的得率为2.929%。然而，CO2用量大、操作压力高、提取时间长是超临界流体萃取中常见的问题。

因此，本研究在传统超临界流体萃取法基础上，改进了实验装置，采用自制萃取釜取代原始萃取室，通过磁力搅拌促进样品与超临界CO2的充分接触，并采用乙醇溶液预先浸渍样品的方法进一步增强萃取过程中超临界流体CO2的溶解力和选择性。本法结合了磁力搅拌和超临界流体萃取的优势，既节约了CO2的用量，又降低了萃取成本，且整个萃取过程在密闭条件下进行，溶剂用量少，对环境无污染。为了考察本法的萃取性能，本研究进行了方法学评价，并将本法与传统超声提取法、微波提取法和回流提取法进行了比较。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

图1 五味子木脂素类化合物的结构Fig.1 The structure of lignans

五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素和五味子乙素标准品（纯度均大于99%），购买于上海阿拉丁试剂公司；安五脂素、五味子酚、戈米辛D和五味子丙素标准品（纯度均大于99%），购买于成都曼斯特试剂有限公司，各化合物结构如图1所示。高纯空气、高纯二氧化碳（纯度＞0.99999），购买于长春巨洋氮气有限公司。甲醇（色谱纯），购买于美国Fisher公司。其它试剂均为分析纯，购买于北京化工厂。

1100型液相色谱仪，配有二极管阵列检测器，美国安捷伦公司；Agilent TC-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，美国安捷伦公司；KQ3200E超声波发生器，昆山市超声仪器有限公司；RE-52AA真空旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；Centrifuge 5430R高速离心机，德国艾本德股份公司；DF-101S集热式磁力搅拌器，巩义市予华仪器有限责任公司；Spe-ed SFE超临界萃取设备，美国ASI应用分离技术公司；SDC-6低温恒温槽，宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 样品制备

本研究对来自不同产地的5个北五味子样品（样品1～5）进行了分析。所有样品经粉碎后过40目筛，在50 ℃下干燥至恒重，并储存在玻璃干燥器中，备用。

1.3 标准溶液的配制

取五味子木脂素标准品5 mg于10 mL棕色容量瓶中，用适量甲醇溶解，并定容至刻度，配制成浓度为500 μg/mL的单个标准储备液，并于4 ℃冰箱中冷藏保存，备用。其它不同浓度的单标和混标溶液是由标准储备液经甲醇稀释后得到的。

1.4 磁力搅拌辅助超临界CO2萃取

图2 实验装置图Fig.2 The diagram of experimental device

实验装置如图2所示。首先，开启低温恒温槽3，设置温度为5 ℃，当达到设定温度后，开启阀门1和2，通入高纯空气和CO2，使空气充满整个增压泵系统，以便于驱动增压泵活塞进行加压，CO2占据整个管路及萃取釜。同时，准确称量5 g五味子样品粉末于自制的萃取釜6中，并加入10 mL无水乙醇，拧紧封口，随后将萃取釜放入集热式恒温磁力搅拌器中预热10 min，打开进口阀8和出口阀7，通入CO2，以排出萃取釜中的空气，然后关闭出口阀7，检查装置气密性，同时开启增压泵和磁力搅拌器（设定转速50 r/min），待萃取釜中压力达到9 MPa时，停止加压，萃取30 min。萃取结束后，依次关闭磁力搅拌器、钢瓶阀门1和2以及进口阀8，并手动旋转增压泵，开始释压，待萃取釜冷却至室温后，开启阀门7，排出气体，取出萃取釜中的固液混合物，并用少量的乙醇反复冲洗萃取釜，将得到的所有固液混合物全部转移到50 mL离心管中，在5000 r/min下离心5 min，取出全部的上清液于50 mL容量瓶中，并用乙醇定容至刻度，取定容后的液体2 mL，减压干燥，残渣用2 mL色谱级甲醇回溶，所得溶液过0.22 μm滤膜后进行色谱分析。

1.5 方法比较

1.5.1 药典方法

根据《中国药典》（2015年版）[1]，取干燥后的五味子样品粉末约0.25 g，精密称定，放入25 mL容量瓶中，加甲醇约18 mL，瓶口密封后，超声提取20 min，取出，冷却至室温，并加甲醇至刻度，混合摇匀后过滤，取滤液2 mL，过0.22 μm滤膜，进行高效液相色谱分析。

1.5.2 热回流提取法

将0.5 g五味子样品粉末和25 mL 50%乙醇溶液加入到圆底烧瓶中，加热回流提取2 h，然后取出全部固液混合物至50 mL离心管中，在5000 r/min下离心5 min，弃去残渣，取全部上清液于50 mL容量瓶中，并定容至刻度，准确量取溶液2 mL，减压干燥，残渣用2 mL甲醇回溶，所得溶液过0.22 µm滤膜，进行高效液相色谱分析。

1.5.3 微波提取法

将0.5 g五味子样品粉末和25 mL 50%乙醇溶液加入到50 mL离心管中，在420 W条件下微波提取1 min，将离心管取出并冷却至室温，在5000 r/min下离心5 min，取上清液定容至50 mL，取溶液2 mL，减压干燥，残渣用2 mL甲醇回溶，所得溶液过0.22 µm滤膜，进行高效液相色谱分析。

1.6 色谱条件

流动相由甲醇（A）和水（B）组成，洗脱梯度条件为：0～10 min，68% A；10～15 min，68%～80% A；15～40 min，80% A；40～42 min，80%～68% A；42～45 min，68% A，流动相流速：0.5 mL/min；进样体积：10 μL；柱温：35 ℃；检测波长：254 nm。

1.7 提取率及回收率的计算

其中，E为提取率，mg/g；C为提取物的浓度，mg/mL；V为提取物的总体积，mL；M为样品总质量，g。

其中，R为回收率，%；C0为初始量，mg/g；C1为加标量，mg/g；C2为检出量，mg/g。

1.8 数据统计分析

萃取条件优化与方法学评价的数据均通过Excel软件进行统计计算，并通过Origin 8.0.6软件作图，使用SPSS 16.0进行统计分析和显著性检验。除特殊说明外，所有实验均平行操作三次。

2 结果与讨论

2.1 提取条件优化

2.1.1 萃取压力

图3 提取压力对提取率的影响Fig.3 Effect of extraction pressure on extraction yield

在本研究中，超临界CO2作为萃取溶剂，其用量大小将对目标物提取率产生至关重要的影响[28-30]。由于整个萃取体系在密闭条件下进行，随着超临界CO2用量的增加，萃取釜中的压力不断增大，因此，本研究考察了萃取压力分别为0、3、7.5、9和12 MPa时对木脂素类化合物提取率的影响。实验结果如图3所示，在不通入CO2的情况下，即萃取压力为0时，目标物质的萃取率较低，在提取压力为3 MPa时，CO2为气体状态，目标化合物的提取率与0 MPa时的提取率相似，仅为8.20 mg/g，但随着提取压力的升高，超临界CO2不断进入样品内部，大大提高了传质效率，当提取压力为9 MPa时，目标分析物的提取率达到最大值。因此，本实验选择提取压力为9 MPa。

2.1.2 乙醇浓度

为了增强萃取过程中超临界CO2的溶解力和选择性，提高萃取效率，降低操作压力，本研究采用少量乙醇溶液预先浸渍样品，考察了乙醇浓度（40%、60%、80%和100%）对目标分析物提取率的影响。实验结果如图4所示，乙醇的浓度越高，目标化合物的提取率越高，当使用无水乙醇时，五味子醇甲的提取率达4.62 mg/g，木脂素类化合物总量为11.80 mg/g。一方面，由于乙醇分子具有较大的极性，这大大增加了木脂素类化合物在超临界CO2中的溶解度[31]；另一方面，乙醇作为一种有机溶剂，易与木脂素类化合物形成氢键，能显著提高萃取效率[32]。因此，本实验选择无水乙醇作为浸渍溶剂。

图4 乙醇浓度对提取率的影响Fig.4 Effect of ethanol concentration on extraction yield

2.1.3 乙醇体积

图5 乙醇用量对提取率的影响Fig.5 Effect of ethanol dosage on extraction yield

合适的样品质量与浸渍溶剂的比例有助于木脂素类化合物的提取。在本研究中，由于所使用的萃取釜的体积为30 mL，因此，考察了当样品质量为5 g时，无水乙醇体积（0、5、10、15和20 mL）对目标物提取率的影响。实验结果如图5所示，当不使用乙醇浸渍样品而直接采用超临界CO2萃取样品时，木脂素类化合物的提取率仅为0.05～1.43 mg/g。随着乙醇体积的不断增大，萃取率不断升高，这可能是因为目标分析物具有联苯环辛二烯母核结构，乙醇作为目标物和超临界CO2的混溶试剂，对超临界萃取效果具有极大的强化作用[31,33]。当乙醇用量为10 mL时，提取率达到最大值，约为0.13～4.45 mg/g。当继续增加乙醇用量时，目标化合物的提取率略有下降。从实验中能观察到，这可能是在提取过程中，由于乙醇用量的增加，使萃取釜中液面升高，导致部分五味子样品黏附于萃取釜壁及顶盖上，无法与萃取溶剂接触，从而使提取率略有下降，此时，总木脂素类化合物提取率仅为最大值的85%。所以，本实验选择乙醇用量为10 mL。

图6 磁力搅拌器转速对提取率的影响Fig.6 Effect of rotating speed of magnetic stirrer on extractionyield

2.1.4 磁力搅拌转速

在传统超临界CO2萃取基础上，本研究改进了实验装置，采用自制的萃取釜代替原有的萃取室，这样可以方便在萃取釜外部加入磁力搅拌装置，通过磁力搅拌有助于样品与萃取溶剂和无水乙醇充分混合，增加萃取溶剂与样品之间的接触频率，从而提高传质速率和萃取效率[34]。因此，本研究考察了磁力搅拌转速（0、25、50、100 r/min）对木脂素类化合物提取率的影响。实验结果如图6所示，当不采用磁力搅拌时，目标分析物的提取率较低，总木脂素提取率不足5.00 mg/g，随着转速的不断增加，提取率不断升高，当转速达到50 r/min时，提取率达到最高，此时，总木脂素类化合物提取率约为11.80 mg/g，继续增加转速时，提取率几乎不变。因此，本实验选择磁力搅拌转速为50 r/min。

2.1.5 提取温度

在中药提取过程中，加热可以促进分子运动，增加目标分析物的溶解性，从而提高传质速率和提取率。此外，在本研究中，温度也是形成超临界CO2十分重要的条件，只有当温度高于31 ℃、压力达到7.19 MPa时，CO2才能处于超临界状态。因此，本实验考察了提取温度（35、50、65和80 ℃）对超临界萃取木脂素类化合物的影响。实验结果如图7所示，从图中可以看出，随温度的升高，目标分析物的提取率几乎不变。这可能是因为在相对较长的时间范围内，超临界萃取已经达到了平衡状态，从而使温度对提取率并未产生显著的影响[35,36]。因此，本研究选择提取温度为35 ℃。

图7 提取温度对提取率的影响Fig.7 Effect of extraction temperature on extraction yield

2.1.6 提取时间

图8 提取时间对提取率的影响Fig.8 Effect of extraction time on extraction yield

提取时间是中药提取过程中一个非常重要的参数，通常情况下，随着提取时间的增加，提取率越来越高，直至目标物提取完全为止[35,36]。因此，本研究考察了提取时间分别为15、30、60、120和180 min时目标分析物的提取率。实验结果如图8所示，当提取时间达到30 min时，目标分析物的提取率不再显著增加，这说明超临界CO2萃取木脂素类化合物已经达到平衡状态。所以，本研究选择的提取时间为30 min。

2.2 方法评价

2.2.1 标准曲线、检出限、定量限、日内和日间精密度

配制含有8种木脂素类化合物的一系列不同浓度的混合标准溶液，进行色谱分析，以目标分析物浓度（c）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，绘制标准曲线，通过Origin 8.0.6软件得出线性回归方程。实验结果如表1所示，各目标分析物在线性范围内具有良好的线性关系，相关系数r＞0.9998。检出限（LOD）和定量限（LOQ）是指信噪比分别为3和10时，仪器所能检出或准确定量的目标分析物的最低浓度。实验结果表明，目标分析物的LOD和LOQ分别为21.30～990.20 ng/mL和60.80～2992.80 ng/mL。采用本研究所建立的分析检测方法1 d内连续分析6次样品所获得提取率的相对标准偏差（RSD）为日内精密度，通过连续分析3 d、每天分析2次样品所获得提取率的相对标准偏差（RSD）为日间精密度，从实验结果可以看出，除五味子酚和五味子甲素外，各目标分析物的日内和日间精密度分别低于4.75%和4.07%，这说明本研究方法的重现性是可以接受的。

2.2.2 回收率的测定

为了研究本方法的准确度，本实验对加标样品的回收率进行了分析。实验结果如表2所示，各目标化合物回收率为75.00%～97.78%，其相对标准偏差（RSD）均低于5.36%，这表明本法具有满意的回收率和精密度，可用于中药中木脂素类化合物的提取与检测。

表1 性能分析Table 1 Analytical performance

表2 加标样品回收率Table 2 Recovery of spiked samples

表3 实际样品分析Table 3 Analysis of real samples

图9 木脂素标准品溶液Fig. 9 Chromatograms of the standard solution

2.2.3 实际样品分析

为了评价本方法的适用性，本研究对五种不同产地的五味子样品进行了分析，其中，1～4号样品为北五味子，产地分别为辽宁、吉林、黑龙江以及内蒙古，5号样品为南五味子，产地为陕西。实验结果如表3所示，研究发现南、北五味子中木脂素含量差异较大，北五味子中木脂素的含量明显高于南五味子，而且，在所检测的8种目标分析物中，五味子醇甲含量最高，可达可达4.36～5.54 mg/g，它常作为五味子药材的标志性成分。此外，无论是北五味子还是南五味子，在五味子醇甲等单个化合物以及总木脂素类化合物的提取率方面，本法所获得的结果与文献报道的方法相一致[37,38]，这说明本方法就有良好的适用性。此外，北五味子不同产地间8种木脂素的含量也存在一定的差异，以标志性成分五味子醇甲为例，样品2的含量明显高于其他三种样品。出现这种差异的原因可能是光照时间、采收时间、当地气候以及土壤条件等因素的差异对五味子中的活性成分造成了一定的影响。木脂素标准溶液和样品提取物色谱图如图9所示。

2.2.4 方法比较

为了评价本方法的实用性，将本方法与药典方法（即超声提取法）、热回流提取法、微波提取法进行了比较，实验结果如表4所示。与其他方法相比，本法在提取时间和实验成本上并不无显著性优势，但从提取效果方面来看，除五味子醇甲、安五脂素和五味子乙素三种化合物外，本法所获得的提取率明显高于微波提取法和热回流提取法，通过t检验发现，本法与药典方法所获得的提取率相似，无显著性差异。此外，热回流提取法作为传统的萃取方法，经常被应用于工业化生产，然而该方法提取过程中使用大量的有机溶剂，且提取时间长，萃取效率低。超声提取法和微波提取法作为近些年出现的新提取方法，具有操作简单、时间短、提取率高等优点，然而这两种方法却无法大量的处理样品，不适合工业化生产，也需要使用较多的有机溶剂。本法使用超临界CO2作为萃取剂，绿色环保无污染，尽管在萃取过程中使用了少量的乙醇作为浸渍溶剂，但料液比仅为1:2，是其他方法的1/25～1/50。本法使用超临界CO2代替传统有机溶剂作为萃取剂，大大减少有机溶剂的用量，具有样品处理量大、操作简单、绿色环保、萃取效率高、提取时间短等优点，后期将着手研究CO2的回收装置，以降低成本。

表4 方法比较Table 4 Comparison between the proposed method and other methods

3 结论

本研究首次将磁力搅拌与超临界流体萃取相结合，建立了一种简单、高效、绿色的磁力搅拌辅助的超临界CO2萃取高效液相色谱法，用于测定五味子中的木脂素类化合物。本方法在传统超临界CO2萃取基础上，改进了实验装置，采用自制的萃取釜代替原有的萃取室，这样可以方便在萃取釜外部加入磁力搅拌装置，有利于将萃取溶剂与样品充分混合，增加萃取溶剂与样品之间的接触频率，从而提高萃取效率。而且，本法改变了传统超临界CO2萃取模式，即以静态萃取代替传统方法中的动态萃取，在不降低萃取率的前提下，与文献报道的方法[28,29]相比，节约CO2用量可达30%～60%。此外，本法在超临界CO2萃取前，预先采用少量无水乙醇作为辅助萃取溶剂浸渍样品，增强了萃取过程中超临界CO2的溶解力和选择性，降低了萃取压力。研究表明，磁力搅拌辅助萃取、乙醇浸渍样品与超临界CO2萃取相组合的萃取方式，明显优于传统的热回流提取法和微波辅助提取法，并获得了与药典方法相近的提取率，本法具有操作简单、环境友好、提取率高等优点，可广泛用于中药中木脂素类化合物的提取分析。