张兴荣，张学林,2，贺连智，徐慧，郑小嘎，李峰，黄艳红

（1.山东省食品发酵工业研究设计院，山东济南 250014）

（2.齐鲁工业大学（山东省科学院),食品科学与工程学院,山东济南 250014）

关键字：黄酮；构树；冷沉；成分分析

构树又称楮树，桑科构树属，广泛分布于东亚和东南亚[1]，抗逆性强，生长迅速、成活率高、易繁殖，是我国主要的构属种植品种[2]。构树叶化学成分复杂，含有丰富的蛋白质、脂肪、糖苷类、萜类、黄酮类、微量元素及多种人体所需的氨基酸、矿物质等，有独特的营养价值[3]，目前主要作为饲料原料[4]，其精加工产品较少且主要集中在蛋白质[5]和多糖[6]的方面，开发利用严重滞后，极大的限制了构树叶的推广和应用。通过现代技术手段提取构树叶中活性成分并对其深加工，可以有效的提高其经济效益，同时也是当前行业研究的重点。

黄酮类物质种类繁多、结构多样，具有抗菌、抗炎[7]、抗氧化[8,9]等作用，在医药[10]、食品、化妆品行业有广泛的应用[11]。已有研究表明，构树叶中含有丰富的黄酮类化合物，如牡荆素、芹菜素、槲皮素、异甘草素、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、7-甲氧基香豆素、东莨菪素、7-甲氧基芹菜素、胡萝卜苷等[1]、具有极高的应用价值。

目前构树叶总黄酮提取工艺的研究较少，汪雁等[12]人以离子液体苯并噻唑甲烷磺酸盐为提取剂，结合超声辅助提取构树叶总黄酮，通过条件优化后测得总黄酮含量为0.4685 mg/g。楚冰芳等[13]人采用超声提取法以乙醇为溶剂，通过正交试验得出最佳条件下构树叶黄酮得率为4.01%。上述方法工艺复杂且溶剂的使用量较大，易造成产品品质的下降，不利于工业化生产和资源环境的保护。本文选择乙醇为溶剂，通过单因素和响应面法优化构树叶总黄酮提取工艺，利用色谱-质谱联用技术为手段，分析并鉴定提取液中黄酮类化合物的种类和结构，以期为构树叶的综合利用提供新的技术和参考，对增加构树产业的附加值，开发高质量的产品具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

构树叶：自然晒干，粉碎过10目筛备用。

芦丁标准品（批号XW01531841），国药集团；甲醇（LC-MS级），德国默克公司；乙腈（LC-MS级），德国默克公司；甲酸（LC-MS级），西亚试剂；亚硝酸钠、硝酸铝、无水乙醇、氢氧化钠等（均为分析纯），国药集团。

1.2 仪器与设备

JD200-3电子分析天平，沈阳龙腾电子有限公司；MW16-HH-6A水浴锅，北京海富达科技有限公司；SIEMENSKK26E28TI冷藏箱，东莞嘉利来电器有限公司；752N紫外可见分光光度计，上海精科仪器有限公司；TD5A台式低速水平离心机，上海赵迪生物科技有限公司；RE-52AA旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；Thermo Vanquish UHPLC超高效液相色谱仪，赛默飞世尔科技公司；Q-Exactive HF高分辨质谱，赛默飞世尔科技公司；Zorbax Eclipse C18（1.8 μm×2.1×100 mm），安捷伦科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 总黄酮提取液的制备

准确称取20.00 g构树叶置于500 mL的锥形瓶中，加入一定量的乙醇溶液，并设定不同的提取温度和时间，浸提过程中每0.5 h搅拌一次，结束后用纱布过滤，重复提取两次合并滤液，滤液再经4 ℃冷沉12 h，3000 r/min离心20 min去除叶绿素等杂质，得上清液即为总黄酮提取液，记录黄酮提取液的总体积。

1.3.2 芦丁标准曲线的绘制及总黄酮的测定

（1）采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法绘制标准曲线及测定总黄酮。

（2）0.1 g/L的芦丁标准溶液的配制[14]：准确称取烘干至恒重的芦丁标准品0.0100 g，用50%的乙醇溶液溶解并定容至100 mL。

分别吸取0.00、0.25、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL的芦丁标准溶液于10 mL的容量瓶中，用50%的乙醇溶液将液体补充至5 mL，并在容量瓶中依次加入5%亚硝酸钠溶液和5%硝酸铝溶液各0.3 mL，混匀后静置6 min，加入4%的氢氧化钠溶液4 mL，最后用50%的乙醇溶液定容至10 mL，混匀静置12 min后在波长504 nm下测吸光度。以容量瓶中芦丁的总含量（μg）为纵坐标，测得的吸光度值为横坐标，绘制标准曲线。

得回归方程为：y=410.44x，R2=0.9998

线性关系良好，满足测定要求。

（3）精密吸取0.1 mL的提取液，按照上述方法测定总黄酮得率，公式如下：

式中：R1：构树叶总黄酮得率，即每g干叶中提取出的黄酮量，mg/g；Y：由标准曲线计算出的反应体系中总黄酮含量，μg；V：提取液总体积，mL；M：原料的投入量，g。

1.3.3 单因素试验

在料液比10%，乙醇浓度80%（体积分数，下同），提取时间2 h的基础上，探讨温度（30、40、50、60、70、80、90 ℃）对总黄酮提取效果的影响；

在温度70 ℃、乙醇浓度80%，料液比10%基础上，探讨时间（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h）对总黄酮提取效果的影响；

在温度70 ℃、乙醇浓度80%、时间2.5 h的基础上，探讨料液比（4%、6%、8%、10%、12%、14%）对总黄酮提取效果的影响；

在温度70 ℃、料液比10%，提取时间2.5 h基础上，考察乙醇浓度（10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%）对总黄酮提取效果的影响；

总黄酮提取液的制备参照1.3.1，得率的测定方法参照1.3.2，料液比设置为构树叶原料占总料液的百分比。

1.3.4 Box-Behnken响应面优化

在单因素实验结果的基础上，以构树叶总黄酮得率为响应值，利用Box-Behnken设计4因素3水平的实验。如表1所示：

表1 Box-Behnken设计因素与水平Table 1 The levels of factors in Box-Behnken

1.3.5 总黄酮化合物成分分析

通过色谱串联质谱（HPLC-MS/MS）技术分析提取物中成分组成，色谱条件[15,16]：C18色谱柱（1.8 μm×2.1×100 mm），流动相为0.1%的甲酸水溶液+纯乙腈，梯度洗脱，柱温为30 ℃，进样量为2 μL，流速0.3 mL/min，自动进样器温度4 ℃。质谱条件：加热器温度325 ℃，鞘气流速45 arb，辅助气流速5 arb，吹扫气流速1 arb，电喷雾电压3.5 kV，毛细管温度330 ℃，S-Lens RF Level 55%，一级全扫描（Full Scan，m/z100～1500）与数据依赖性二级质谱扫描(dd-MS2，TopN=10)，采用正、负检测模式。使用Compound Discoverer 3.0进行保留时间矫正、峰识别、峰提取等工作，根据二级质谱信息利用Thermo mzCloud在线数据库和Thermo mzValut本地数据库，进行物质鉴定。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果分析

2.1.1 温度对构树叶总黄酮得率的影响

不同温度对总黄酮得率的影响结果见图1，当温度小于70 ℃时，温度与黄酮得率成正相关，升高体系温度能加速溶剂分子的运动，从而提高了黄酮类化合物的析出速率。但是这些化合物有一定的热敏性，当温度过高时，其分子结构遭到破坏，同时高温会使构树叶中的蛋白质凝固，黄酮不易析出，导致得率下降[12]。结果显示在70 ℃时，总黄酮的得率最高，为20.57 mg/g。

图1 提取温度对构树叶总黄酮得率的影响Fig.1 Effect of extraction temperature on yield of flavonoids from Broussonetia papyrifera leaves

2.1.2 时间对构树叶总黄酮得率的影响

图2 提取时间对构树叶总黄酮得率的影响Fig.2 Effect of extraction time on yield of flavonoids from Broussonetia papyrifera leaves

不同时间对总黄酮得率的影响结果如图2所示，在0.5～2.5 h内随着时间的增加，黄酮类化合物溶出的越来越充分，因此得率不断增加。当时间大于2.5 h时，高温长时间的作用，导致部分成分受热分解[17]，得率下降，结果分析可知，提取时间为2.5 h时总黄酮的得率最高为22.59 mg/g。

图3 料液比对构树叶总黄酮得率的影响Fig.3 Effect of liquid to material ratio on yield of flavonoids from Broussonetia papyrifera leaves

2.1.3 料液比对构树叶总黄酮得率得率的影响

不同料液比对总黄酮得率的影响结果如图3所示，在料液比较低时，溶剂与原料充分接触，溶质的析出量增加，黄酮提取的更加充分得率较高，但是溶剂的使用量大会增加生产成本，同时增加提取过程中黄酮的损耗。在料液比10%时提取物的浸出达到平衡，之后随原料的增加，料液比变大，原料与溶剂之间的接触面积变小[18]，同时体系的流动性变差，得率下降。综合考虑选取料液比为10%，此时总黄酮得率为26.57mg/g。

2.1.4 乙醇浓度对构树叶总黄酮得率的影响

图4 乙醇浓度对构树叶总黄酮得率的影响Fig.4 Effect of ethanol concentration on yield of flavonoids from Broussonetia papyrifera leaves

不同乙醇浓度对总黄酮得率的影响结果如图4所示，乙醇浓度对总黄酮得率影响显著，在乙醇浓度为30%时得率最高，此时溶液的极性与黄酮类化合物的极性相似，黄酮类物质更易溶出。随着乙醇浓度的增大，浸提液的颜色加深，醇溶性杂质、色素、亲脂性物质等浸出量增加，竞争性地与乙醇结合，影响了黄酮类化合物与溶剂之间的作用效果[19]，得率下降。因此选择乙醇浓度为30%，此时总黄酮的得率为35.15 mg/g。

综合分析上述单因素结果，选择提取温度70 ℃，提取时间2.5 h，料液比10%，乙醇浓度30%为响应面实验设计的中心点。

2.2 响应面实验结果分析

2.2.1 回归方程的建立

以取料液比、温度、时间、乙醇浓度四个因素，研究其对构树叶总黄酮得率的影响，因素和水平的取值范围参考单因素实验结果，响应面实验结果如表2所示。

利用Design-ExpertV8.0.6软件对实验数据进行回归性分析，得到总黄酮得率R1对A（乙醇浓度）、B（提取温度）、C（提取时间）、D（料液比）的二次回归方程模型：

表2 Box-Behnken试验设计及结果Table 2 Design and result in Box-Behnken

2.2.2 模型方差及交互作用分析

如表3所示，该模型F值为91.06，p＜0.0001，差异性显著，同时失拟项p=0.2017＞0.05，模型的拟合度良好。相关系数R2=0.9379及失拟项系数R2=0.9783，说明模型预测值与实际值拟合较好，自变量与响应值之间关系显著，可以用此模型来分析和预测构树叶总黄酮得率。由F值得到的各因素的贡献率为A＞B＞C＞D，其中乙醇浓度（A）和温度（B）对总黄酮得率影响极显著。不同因素之间的交互作用如图5所示，其中AC、BC为显著项，其他均为不显著项，表明提取温度B和提取时间C两者之间的交互影响明显，其他因素之间的交互作用不明显。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

图5 两因素相互作用的3D图Fig.5 Contour plot of effects of the interaction of tow factors on extraction of flavones

表4 黄酮类成分解析Table 4 Identification of flavonoids constituents

图6 构树叶黄酮提取物总离子流图Fig.6 TIC chromatogram of flavonoids from Broussonetia papyrifera leaves

2.2.3 最佳工艺条件预测验证

模型给出的理论最佳工艺参数为乙醇浓度29.82%、温度69.35 ℃、提取时间2.49 h、物料比9%，总黄酮得率理论值为37.10 mg/g。考虑到实际操作将理论参数调整为乙醇浓度30%，提取时间2.5 h，温度69 ℃，物料比9%，在此条件下测得构树叶中总黄酮得率为37.33 mg/g，与模型预测值接近，响应面设计实验所给出的总工艺结果可靠。

2.3 提取物中黄酮类化合物分析鉴定

对冷沉离心后的上清液进行UPLC-MS/MS分析，电喷雾正、负离子模式下的质谱信息见图6。

使用Compound Discoverer 3.0分析图谱，由一级质谱的分子离子峰拟合元素组成，得到化合物的分子式，再结合二级质谱的离子碎片峰及质谱裂解规律，利用Thermo mzCloud在线数据库、Thermo mzValut本地数据库和相关参考文献推导化合物的结构。通过分析，提取液中检测出了脂肪类、吲哚类、羧酸及其衍生物、有机氮类、黄酮类等化合物，其中黄酮类化合物有11种，分子量在270～470之间，黄酮苷元类化合物有山奈酚、高良姜素、芹菜素；黄酮苷类化合物有芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷、野黄芩苷、木犀草苷、芹甙元-7-葡萄糖苷、6-O-对羟基苯甲酰基桃叶珊瑚苷、异牡荆苷、白杨素8-C-葡萄糖苷，其中野黄芩苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷相对含量较高，分别为395.70、612.50 μg/ mL（表4）。

3 结论

本研究以构树叶为原料，通过选取温度、时间、料液比、乙醇浓度四个因素，采用单因素和响应面优化后得到的最佳工艺条件为乙醇浓度30%、提取时间2.5 h、温度69 ℃、料液比9%，在此条件下总黄酮得率为37.33 mg/g。冷沉离心处理能出去提取液中大部分的蛋白质和叶绿素等，并不会对总黄酮的含量产生明显的影响。通过UPLC-MS/MS分析，检测出提取液中的成分中共含有11种黄酮类化合物，分别为野黄芩苷、荭草苷、芹黄素-7-O-葡萄苷、山奈酚、芹菜素、木犀草苷、高良姜素、芹菜素-7-葡萄糖苷、牡荆素葡萄糖苷、6-O-对羟基苯甲酰基桃叶珊瑚苷、牡荆素鼠李糖苷。本研究采用传统的浸提工艺，以乙醇为溶剂在不加超声波、微波等辅助条件的情况下，构树叶总黄酮的得率较高，且溶剂的使用量小成本低，工艺操作简单、安全。色谱-质谱联用技术的应用更加深入的解析了黄酮类化合物的组成及结构，能够为构树叶黄酮的工业化生产提供科学基础和理论依据。