高一芳，刘雪婷，闫仲丽，杨文清，李西西，王昌禄，李风娟

（1.天津科技大学食品科学与工程学院，省部共建食品营养与安全国家重点实验室，食品营养与安全教育部重点实验室，天津 300457）（2.天津科技大学现代分析技术研究中心，天津 300457）

高血压是引发心脑血管疾病的主要风险因素之一，肾素-血管紧张素系统（RAS）是机体重要的血压调节系统，其中，肾素是该系统级联反应的起始限速酶，肾素水解血管紧张素原生成血管紧张素-Ⅰ，血管紧张素-Ⅰ会在血管紧张素转化酶（ACE）的催化作用下进一步水解为具有强血管收缩作用的血管紧张素-Ⅱ，从而导致机体血压升高[1]。抑制肾素和ACE的活性被认为是预防和治疗高血压的有效手段。合成的肾素抑制剂阿利吉仑、ACE抑制剂卡托普利等广泛应用于临床上高血压的治疗，但其长期服用会导致干咳、过敏、味觉障碍等副作用[2]。因此，新型安全有效的肾素和ACE抑制剂广受研究人员的关注。近年来一些研究报道了从食品中发现的天然肾素和ACE抑制活性物质，如大麻籽[3]和红海藻中[4]的小分子肽、花生[5]和水牛奶[6]的蛋白水解物等。值得注意的是，与肽类物质相比，一些食源性多酚化合物[7]表现出优异的肾素抑制活性，这为挖掘新型血压调控因子及相关食品资源提供了新的思路。

在我国乃至世界范围内，食用花卉以其良好的营养价值和独特的色泽、风味，自古应用于居民膳食，其中牡丹花（Paeonia suffruticosaAndr.）具有很高的营养价值，富含类黄酮、多酚类物质，其健康促进作用逐步被现代研究所证实，广泛应用于食品、饮料及化工行业[8,9]。芍药（Paeonia lactifloraPall.）作为一种中药材，与牡丹为同科同属植物，在花型和营养成分上具有极大的相似性。本文旨在考察食用牡丹花对RAS系统中两种关键酶肾素和ACE的抑制作用，选取典型的花色品种，并与芍药进行比较；同时由于血管的氧化损伤与高血压的发生发展关系密切[1]，进一步考察了样品的抗氧化活性，并分析多酚、黄酮类物质的含量与其功能活性的相关性，为探讨新型血压调控因子提供新思路，且为进一步健全食用牡丹花的功能价值体系、实现其高值化利用及促进相关食用花卉食品产业的发展提供更丰富的基础理论依据。

1 材料与方法

1.1 试材与取样

所试牡丹与芍药为市售花产品，分别为武皇牌牡丹全花（白色，白1）、山东菏泽白牡丹花瓣（白色，白2）、山东菏泽红牡丹花瓣（红色，红1）、河南洛阳红牡丹花球（红色，红2）、安徽亳州芍药花瓣（红色，红芍1）、安徽亳州芍药花球（红色，红芍2）。

1.2 试剂及主要仪器设备

人重组肾素抑制剂筛选分析试剂盒购自美国Cayman公司，水溶性维生素E（Trolox）购自美国MCE公司，ACE酶（0.1 U，源于兔肺）、马尿酰组氨酰亮氨酸（HHL）、邻苯二甲醛（OPA）、没食子酸、儿茶素、DPPH自由基和ABTS自由基购自美国Sigma公司，其它试剂均为分析纯。

实验使用的仪器主要有Flx-800荧光酶标仪，美国BioTek公司；Model 1680酶标仪，瑞士Tecan公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品水提物的制备

取干燥后的四种牡丹花瓣、两种芍药花瓣样品研磨后的粉末各1 g，溶于10 mL水中，震荡1 min，超声5 min，28 ℃摇床振荡提取90 min后，离心，取上清液过0.45 μm滤膜，制得样品水提液，标记为100 mg/mL，4 ℃冷藏备用。

1.3.2 肾素抑制活性的测定

肾素抑制活性的评价使用人重组肾素抑制剂筛选试剂盒。具体步骤为，在96孔酶标板小孔中依次加入：（1）空白：20 μL底物，160 μL缓冲液，10 μL蒸馏水；（2）对照：20 μL底物，160 μL缓冲液，10 μL蒸馏水；（3）样品：20 μL底物，160 μL缓冲液，10 μL样品溶液。然后向空白对照和样品孔中加入10 μL肾素酶液启动反应，37 ℃静置15 min。

该试剂盒中的底物是一种合成荧光共振能量转移肽，其一端与荧光团连接，另一端与非荧光发色团连接，被肾素裂解后，获得的产物高度荧光，可通过记录其荧光吸收强度（IF）来计算样品的肾素抑制率。测定条件：激发波长360 nm，发射波长528 nm。每个样品重复三次进行测定。肾素抑制活性计算公式如下：

1.3.3 ACE抑制活性的测定

香味成分是决定酒样的香气、口感和风格的关键因素[6]。黑米酒中香气成分GC-MS分析的总离子色谱图见图1，分析结果见表1。

对ACE抑制活性的测定参照Li等[10]的方法。将样品水提物适当稀释，以96孔酶标板作为反应容器。将15 μL样液（对照反应液中以蒸馏水代替）与30 μL 4.66 mmol/L的HHL溶液（溶于0.6 mol/L NaCl-0.4 mol/L磷酸盐缓冲液，pH 8.5）混合，然后加入30 μL 12.5 mU/mL的ACE酶液（样品反应液和对照反应液的空白以蒸馏水代替），混匀后于37 ℃反应1 h，加入120 μL 1.2 mol/L NaOH溶液终止反应，接着加入30 μL 2%的OPA溶液（溶于甲醇），混匀，室温下静置20 min后加入30 μL 6 mol/L的HCl溶液终止衍生反应。将反应液稀释30倍后测定荧光吸收强度，条件如下：激发波长340 nm，发射波长455 nm。样液的ACE抑制率计算公式为：

ACE抑制率/%=(1-I1/I2)×100% （2）

式中：I1表示样品反应液即存在ACE抑制剂时的荧光吸收强度；I2表示对照反应液即无ACE抑制剂时的荧光吸收强度。抑制率为50%时抑制剂的浓度为半抑制浓度（IC50）。

1.3.4 DPPH自由基清除能力的测定

取5 μL样品水提物和250 μL 0.08 mg/mL DPPH反应液混合，用相同体积的乙醇作空白对照。暗处反应30 min后测定在波长517 nm处的紫外吸光度，计算清除率，以Trolox为对照。样品的DPPH自由基清除能力值表示为每克样品（干质量）所具有的抗氧化能力相当于多少毫克Trolox，即mg TE/g DW。

1.3.5 ABTS自由基清除能力的测定

取25 μL样品水提物（浓度稀释到5 mg/mL），加入ABTS反应溶液（5 mL 7 mmol/L ABTS溶液和88 μL 140 mmol/L的过硫酸钾溶液避光反应12 h，用时用乙醇稀释至波长732 nm处吸光度为0.70±0.02）2 mL，反应30 min后，测定波长732 nm处的吸光度，计算清除率，以Trolox为对照。最后样品的ABTS自由基清除能力值表示为每克样品（干质量）所具有的抗氧化能力相当于多少毫克Trolox，即mg TE/g DW。

1.3.6 FRAP还原能力的测定

TPTZ工作液的制备：25 mL 0.3 mol/L醋酸盐缓冲液（pH 3.6）、2.5 mL 10 mmol/L TPTZ溶液（40 mmol/L HCl溶解）和2.5 mL 10 mmol/L FeCl3·H2O溶液混合，现用现配。

取10 μL样品水提物（浓度稀释到5 mg/mL），加入1 mL蒸馏水和1.8 mL TPTZ工作液，混匀后37 ℃保温10 min，在593 nm处测定紫外吸光值，以Trolox为对照。样品的铁离子还原能力值表示为每克样品（干质量）所具有的还原能力相当于多少毫克Trolox，即为mg TE/g DW。

1.3.7 总酚（TPC）含量的测定

采用福林-肖卡法，以96孔酶标板作为反应容器，依次加入100 μL样品水提物、100 μL Folin-Ciocalteu显色剂和100 μL 10% Na2CO3溶液，37 ℃保温1 h后测定750 nm处的吸光值，以没食子酸为标准品。将结果换算为每克样品（干质量）中所含的多酚相当于没食子酸的毫克数（mg GAE/g DW）。

1.3.8 总黄酮（TF）含量的测定

采用NaNO2-AlCl3法，以96孔酶标板作为反应容器，依次加入20 μL样品水提物、125 μL蒸馏水和75 μL 5% NaNO2溶液，反应6 min后再加入15 μL 10%AlCl3·6H2O溶液。室温静置5 min后加入50 μL NaOH溶液，最后在510 nm处测定紫外吸光度，以儿茶素为标准品，将结果换算为每克样品（干质量）中所含的总黄酮相当于儿茶素的毫克数（mg CE/g DW）。

1.3.9 统计分析

每组实验重复三次，结果用平均值表示，采用Origin软件处理数据，用SPSS软件进行方差分析（p＜0.05）及相关性分析（p＜0.01）。

2 结果与讨论

2.1 肾素和ACE抑制作用分析

图1 不同样品水提物的肾素和ACE抑制作用Fig.1 Inhibition on renin and ACE by different aqueous sample extracts

所试样品水提物的肾素及ACE抑制作用如图1所示。在样品水提物浓度为0.27 mg/mL的条件下，红色的牡丹和芍药花水提物均表现出强肾素和ACE抑制作用，其中肾素抑制率范围为67%～72%，ACE抑制率范围为56%～84%。相比之下，两种白色的牡丹花水提物表现出很弱的肾素和ACE抑制作用。对于高活性的洛阳红牡丹花瓣（红2）和亳州芍药花瓣（红芍2）水提物，其浓度-活性曲线如图2所示。

图2 样品水提物在不同浓度下的肾素和ACE抑制作用Fig.2 Inhibition on renin and ACE by aqueous sample extracts at different concentrations

样品红2和红芍2水提物抑制肾素的IC50值均为0.08 mg/mL，抑制ACE的IC50值分别为0.23和0.25 mg/mL。可以看出，所试红色牡丹和芍药虽为两个不同的原料品种，但其水提物都具有很强的肾素和ACE抑制活性，且无明显差异。就所试牡丹花而言，白色和红色样品水提物的肾素和ACE抑制活性差异显著，说明牡丹的花色及相应化学组成的差异显著影响样品的潜在血压调控作用。本研究首次指出了红色牡丹和芍药花水提物具有优良的肾素和ACE抑制活性,相比于其它已报道的天然肾素和ACE抑制剂，如豆科植物（除大豆花生外）提取液抑制肾素活性的IC50为0.27～1.75 mg/mL[11]；绿茶提取液抑制肾素活性的IC50为0.48 mg/mL[12]；可口革囊星虫蛋白酶水解物不同组分抑制ACE活性的IC50值为0.43～1.41 mg/mL[13]；绿色大豆蛋白酶解物抑制ACE活性的IC50值为0.14～1.14 mg/mL[14]，本研究所试红色牡丹花水提物具有强的肾素和ACE双重抑制活性，可被视为天然肾素和ACE抑制活性物质的重要来源。

2.2 抗氧化能力分析

图3 不同样品水提物的抗氧化能力Fig.3 Antioxidant capacity of different aqueous sample extracts

样品水提物的ABTS和DPPH自由基清除能力及铁离子还原能力如图3所示。红色的牡丹和芍药花水提物均显示出很强的抗氧化能力；而白色牡丹花水提物的抗氧化活性很弱。红色牡丹和芍药样品水提物的抗氧化能力无明显差异，其清除ABTS自由基能力为115.89～121.75 mg TE/g DW，清除DPPH自由基能力为192.67～200.46 mg TE/g DW，铁离子还原能力为119.86～208.94 mg TE/g DW，红色的牡丹和芍药花水提物的抗氧化能力是白色牡丹花水提物抗氧化能力的5倍以上。史国安[15]等研究表明，红色牡丹品种“洛阳红”具有较好的氧自由基清除能力，对O2-的清除能力达85.1%～92.8%，对OH自由基的清除能力达52.1%～89.8%。综合来看，牡丹花具有较高的抗氧化能力，尤其深色系的牡丹品种比浅色系抗氧化能力更强，这与孙泽飞[16]等的研究相一致。

2.3 总酚和总黄酮含量分析

图4 不同样品水提物的总酚和总黄酮含量Fig.4 Contents of total phenols and flavonoids in different aqueous sample extracts

样品水提物的总酚和总黄酮含量如图4所示，红色系的牡丹和芍药花水提物总酚含量都很高，并且显著高于白色牡丹花水提物，红色牡丹和芍药花水提物总酚含量为99.29～122.45 mg GAE/g DW，而白色牡丹花水提物（白1和白2）的总酚含量分别为16.21和23.95 mg GAE/g DW。就总黄酮含量而言，红色牡丹和芍药花水提物仍高于白色牡丹花水提物，红色牡丹和芍药花水提物总黄酮含量为3.71～7.34 mg CE/g DW之间，而样品白1和白2水提物的总黄酮含量分别为2.06和1.02 mg CE/g DW。

牡丹花和芍药花属多酚含量较高植物，其酚类物质主要为黄酮类化合物。多酚类化合物一直作为抗氧化活性物质被广泛研究，值得注意的是，多酚类化合物陆续被发现具有肾素和ACE抑制活性，如红茶和乌龙茶中的茶多酚[12]、玫瑰花蕾中的黄酮类化合物[17]、苦杏仁叶[18]和猕猴桃[19]中的多酚提取物、大豆中的大豆皂苷[11]等，这些研究表明多酚类化合物可被视为一类重要的肾素和ACE抑制活性物质。

2.4 相关性分析

所试牡丹和芍药花样品水提物的活性与总酚和总黄酮含量的相关性分析如表1所示。可以看出，牡丹和芍药样品水提物的肾素和ACE抑制活性、抗氧化能力均与总酚含量呈显著的正相关（p＜0.01），而与总黄酮含量没有显著的相关性。其中，总酚含量与肾素和ACE抑制作用的相关系数分别为0.99和0.91，总酚含量与DPPH、ABTS自由基清除能力和铁离子还原能力的相关系数分别为0.99、0.99、0.98。本研究发现白色牡丹和红色牡丹及芍药的肾素与ACE抑制作用及抗氧化活性差异显著，红色样品水提物的活性显著高于白色牡丹花样品，其中的多酚类化合物可能对肾素和ACE抑制活性发挥着重要作用。研究表明多酚类化合物是牡丹花具有抗氧化能力的基础，同时也使牡丹花具有多种重要的生物活性如抗肿瘤、抗糖尿病、抗流感、抗菌、护胃等[20]。而李想[21]等发现类黄酮是影响牡丹花色形成的主要色素类型，可推测白色和红色牡丹的肾素和ACE抑制活性差异亦可能受其类黄酮物质影响。

表1 不同样品水提物的功能活性与总酚和总黄酮含量的相关性分析Table 1 Correlation analysis between activities and contents of total phenols and flavonoids of different aqueous samples extracts

3 结论

本研究首次指出了红色牡丹和芍药花水提物具有优良的肾素和ACE抑制活性（河南洛阳红牡丹和安徽亳州芍药花水提物抑制肾素的IC50值均为0.08 mg/mL，抑制ACE的IC50值分别为0.23 mg/mL和0.25 mg/mL），且与白色牡丹花相比，具有很高的ABTS、DPPH自由基清除能力及铁离子还原能力。同时，不同样品水提物的肾素和ACE抑制活性及抗氧化能力与多酚含量呈显著正相关（p＜0.01）。目前正在对红色牡丹花水提物中的肾素及ACE抑制活性成分进行纯化鉴定及作用机制探讨。此外，牡丹花品系丰富，除了常见的红色和白色花系外，还有黄、粉、紫、墨、绿等不同花系，有必要对不同花系样品的肾素和ACE抑制活性进行更深入的研究，为新型血压调控功能因子的挖掘及牡丹花的高值化利用及食用花卉相关产业的发展提供理论支撑。