朱颖洁，杨亚洁，李群和，邹盈，罗自生,3,4

（1.浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江杭州 310058）（2.温州科技职业学院，浙江温州 325006）（3.浙江大学宁波研究院，浙江宁波 315100）（4.浙江大学馥莉食品研究院，农业部农产品采后处理重点实验室，智能食品加工技术与装备国家地方联合工程实验室，浙江省农产品加工技术研究重点实验室，浙江杭州 310058）

栀子果实是一种重要的药食两用资源，现代药理研究表明，栀子果因富含黄酮类、类胡萝卜素、萜类等生物活性物质[1-3]，具有抗炎、保肝、抗抑郁等功效。西红花酸及其衍生物是栀子果中主要的水溶性类胡萝卜素，其主链上的异戊二烯共轭双键系统是发色基团，使栀子果呈现出黄色至深红色，可在食品工业中用作天然着色剂，代替人工合成着色剂[4,5]。此外，栀子果的含油量较高，大约为干果重量的15%，并且精炼后的栀子油可以与橄榄油媲美，其酸价和抗氧化值都比较低[6]，作为一种高端食用油具有广阔的市场。

在工业上通常采用己烷等传统有机溶剂从油料作物中提取油，但在生产过程中有可能存在溶剂残留，这将导致食品安全和公共卫生问题[7]，因此，寻找一个更加绿色安全并且高效食用油提取溶剂是当前行业研究者们共同关注的问题。Natalia Castejón等[7]用正己烷、乙酸乙酯和乙醇作为萃取溶剂从车前草种子中提取油，结果表明在超声辅助提油过程中，55 ℃、30 min时乙醇获得了最佳油得率，其次是正己烷和乙酸乙酯。此外，还有一些研究采取D-柠檬烯、a-蒎烯、对伞花烃[8]、植物油[9]等新型溶剂提取植物油，由于这些溶剂溶解性质和正己烷相近，因此也获得了较高的得油率。但这些提取物需经过加水或乙醇进行二元或者三元共沸，才能将提取溶剂的沸点降低到100 ℃以下，从而达到提取溶剂与提取的粗油分离的目的[8]，这不仅会破坏粗油中的生物活性物质，而且由于成本过高，难以在生产上应用。

研究表明，栀子果提取物的有效化学成分表现出中-高极性，适于水溶液、95%～70%乙醇溶液提取[10]。乙醇是一种常见的低成本的“绿色生物溶剂”，其对环境无污染，沸点比正己烷低，是一种经济安全的溶剂，已被研究作为提取食用油的替代溶剂[11,12]。由于乙醇极性易于提取微量的营养化合物如生育酚[13]，可提高油的品质。然而，乙醇提取栀子果油的同时也会提取出一些不溶性化合物如磷脂、色素和糖，这些物质需要从油中分离。Sánchez R.J等[14]通过加入正己烷分馏进而达到分离的目的，但仍会存在正己烷残留问题。

超声辅助提取技术(UAE)近年来已被作为一种高效廉价的手段来提取生物活性化合物和植物油脂[15-17]。超声优化提取效率的机制在于超声的机械效应和空化作用，可以促进提取物细胞破裂，增强待提取物质跨细胞膜传送速率[18]。因此，本研究通过评估超声辅助绿色溶剂（乙醇、乙酸乙酯）从栀子果中提取粗油的抗氧化能力，并与使用超声辅助正己烷提取栀子果油的抗氧化能力进行比较，旨在分析各提取物中抗氧化活性物质的成分及含量，以确定主要的抗氧化活性物质，为栀子果油高值绿色提取提供依据。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

栀子干果，购于温州瑞安市。

Supelco 37 Component FAME混合物、甲醇（HPLC级，纯度≥99.7%）、正己烷（HPLC级，纯度≥99.8%）、乙腈（LC-MS级），均购于阿拉丁试剂公司。D-α-生育酚（纯度≥97%）、DPPH（纯度≥97%）、ABTS（纯度≥98%），阿拉丁试剂公司。D-β-生育酚（纯度≥98%），上海源叶生物试剂公司。D-δ-生育酚（纯度≥98%），北京索莱宝科技有限公司。没食子酸、原儿茶酸、对羟基苯甲酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、香草醛，、表儿茶素、对羟基肉桂酸、丁香醛、对香豆酸、阿魏酸、芥子酸、肉桂酸、HPLC≥97%，一飞生物试剂公司；5α-胆甾烷、麦角甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇、HPLC≥98%，阿拉丁试剂公司；CrocinⅠ（CAS：42553-65-1）、CrocinⅡ（CAS：55750-84-0）、Crocetin（CAS：27876-94-4）、HPLC≥98%，上海源叶生物试剂公司。

1.2 仪器与设备

超声均质机，宁波新芝生物；RE-52A旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；Eppendorf Centrifuge 5430R离心机，艾本德上海国际贸易公司；MULTISKAN MK3酶标仪，赛默飞世尔（上海）仪器有限公司；METTLER TOLEDO XS105、XPR10/AC分析天平（瑞士METTLER TOLEDO），干式氮吹仪UGC-24M（北京优晟联合科技有限公司）。Agilent-1100（美国）液相色谱仪（High-performance liquid chromatography，HPLC），配备荧光检测器。Acquity TM ultra型超高效液相色谱仪（Ultra performance liquid chromatography，UPLC）（美国Waters），三重四极杆-高分辨飞行时间质谱联用仪（UPLC-Triple-TOF/MS）（美国AB SCIEX）。GC2014（日本岛津）气相色谱仪（Gas chromatography，GC），配 有 自 动 进 样 器。Agilent7890b-7000c（美国）气相色谱质谱联用仪（Gas chromatography - mass spectrometry，GC-MS），配有自动进样器，MassHunter数据处理软件，NIST 14质谱数据库。

1.3 试验方法

1.3.1 正己烷、乙酸乙酯、乙醇超声提取栀子油

称取15 g栀子粉，记为m干物质，量取120 mL有机溶剂，以固液比1:8进行提取；设置超声温度40 ℃，时间20 min，超声功率200 W；之后4 ℃，8000 r/min，15 min离心分离取上清放入旋蒸仪中，-0.1 MPa，40 ℃蒸到恒重；得到的粗油在4 ℃冰箱静置过夜，冬化沉淀油渣，4000 r/min，5 min离心弃去油渣，记录下液体质量m油；计算得油率：

1.3.2 自由基清除能力

DPPH：将400 μL的DPPH储备液加入400 μL样品，摇匀避光静置30 min，于517 nm处测得其吸光值记为Ai，做3次平行实验。将400 μL无水乙醇加入400 μL样品，摇匀避光静置30 min，于517 nm处测得其吸光值记为Aj。最后400 μL无水乙醇加入400 μL DPPH储备液，摇匀避光静置30 min，于517 nm处测得其吸光值记为Ac。按下式计算待测样品对DPPH自由基的清除率(K)：

ABTS：将600 μL的ABTS工作液加入200 μL样品，摇匀避光在30 ℃下静置5 min，于734 nm处测得其吸光值记为Ai，做3次平行实验。将600 μL的无水乙醇加入200 μL样品，摇匀避光在30 ℃下静置5 min，于734 nm处测得其吸光值记为Aj。最后600 μL ABTS工作液加入200 μL无水乙醇，摇匀避光在30 ℃下静置5 min，于734 nm处测得其吸光值记为Ac。按下式计算待测样品对ABTS自由基的清除率(K)：

IC50值计算：将清除率K对浓度梯度的曲线用Prism 8.0软件进行拟合计算出IC50。

1.3.3 脂肪酸图谱

称取样品0.0600 g，放入10 mL离心管中，加4 mL正己烷溶解；加入2 mol/L的氢氧化钾/甲醇溶液0.4 mL，涡旋振荡30 s，静置至澄清，向溶液中加入1 g硫酸氢钠，猛烈振摇，中和氢氧化钾。待盐沉淀后，取上清液经0.22 μm滤膜过滤，滤液于气相进样瓶中供气相色谱分析。GC条件：色谱柱：DB-23毛细管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm），载气（99.999% N2），柱流速1 mL/min；进样口：进样量1 μL，气化室温度250 ℃，分流进样，分流比10:1；升温程序：初始温度100 ℃，保持2 min，以10 ℃/min到160 ℃，保持4 min，再以10 ℃/min到 210 ℃，保持5 min，最后以10 ℃/min到240 ℃，保持10 min；检测器温度300 ℃。

1.3.4 酚酸含量

取0.5 g油样，1.5 mL、1.5%甲酸/甲醇溶液（V/V）提取三次，每次涡旋2 min，合并提取液8200 r/min离心6 min，取甲醇层。氮吹至干后复溶于500 μL甲醇，上清C18（Agilent ZORBAX-SB，250 mm×4.6 mm，5 μm）-HPLC测定。流动相由0.02%磷酸（V/V，溶液A）和乙腈（溶液B）组成，流速为1.0 mL/min，梯度程序为0～40 min，溶液B：2%～25%；40～45 min，溶液B：25%～35%；和45～50 min，溶液B：35%～50%。注射量为10 μL，柱温为29 ℃，扫描波长设置为254 nm～370 nm。分析前用0.22 μm滤膜过滤样品。各化合物的鉴别和定量分别根据已知的标准化合物保留时间和线性方程进行计算。

1.3.5 西红花素及其衍生物含量

取0.5 g油样，3 mL、50%甲醇（V/V）提取两次，每次涡旋2 min，合并提取液8200 r/min离心6 min，取甲醇层。氮吹至干后复溶于600 μL或5 mL（仅ECP一个样品）甲醇，上清C18（AQ，250 mm×4.6 mm，5 μm）-HPLC测定。流动相由0.02%磷酸（V/V，溶液A）和甲醇（溶液B）组成，流速为1.0 mL/min，梯度程序为0～4 min，溶液B：0～10%；4～50 min，溶液B：10%～90%；51～55 min，溶液B：90%～10%。注射量为10 μL，柱温为40 ℃，扫描波长设置为440 nm。分析前用0.22 μm滤膜过滤样品。各化合物的鉴别和定量分别根据已知的标准化合物保留时间和线性方程进行。质谱采用Triple-TOF 5600+飞行时间液质联用仪，负离子扫描模式；扫描范围：m/z100～1500；雾化气(GS1)：50 psi；干燥气(GS2)：50 psi；气帘气(CUR)：35 psi；离子源温度(TEM)：550 ℃；离子源电压(IS)：-4500 V；一级扫描：去簇电压(DP)：80 V；聚焦电压(CE)：10 V；二级扫描：使用TOF MS～Product Ion～IDA模式采集质谱数据，CID能量为-20、-40和-60 V，进样前，用CDS泵做质量轴校正，使质量轴误差小于2×10-6。

1.3.6 生育酚含量

将栀子果油样品（50 mg）溶于2 mL甲醇，10000 r/min离心10 min取上清，通过C18-HPLC/FLD（Waters，150×4.6 mm，3 μm）上样分析，设置为295 nm（Ex）和335 nm（Em）。流动相为甲醇/水（93:7，V/V），流速为1 mL/min，柱温40 ℃。运行时间为13 min。样品进样量为20 μL。各化合物的鉴别和定量分别根据已知的标准化合物保留时间和线性方程进行计算。

1.3.7 甾醇含量

以5α-胆甾烷（50 μg）为内标，用1 mol/L氢氧化钾/甲醇溶液在25 ℃下将20 mg栀子果油样品皂化18 h。皂化后，加入5 mL二氯甲烷和5 mL水，摇匀混合物，用二氯甲烷提取植物甾醇。然后将水除去，并用水冲洗有机相三次，直到溶液澄清。最后氮吹蒸发有机相。向棕色瓶中加入100 μL BSTFA+TMCS（99:1，V/V）进行衍生化，80 ℃甲硅烷基化反应40 min后溶解于1 mL正己烷中，GC-MS上样分析。色谱条件：色谱柱HP-5（30 m×0.25 mm×0.32 μm）；载气（99.99% He）；流速1.0 mL/min；进样口温度300 ℃；不设置分流比；进样量1 μL；起始温度100 ℃，保持1 min，以50 ℃/min升至200 ℃，再以1.5 ℃/min升至300 ℃，保持10 min；质谱条件：EI离子源；离子源温度250 ℃；传输线温度300 ℃；电子能量70 eV；质量扫描范围m/z50～600 u。

1.3.8 数据处理

试验数据采用Excel 2010和SPSS Statistics 20.0统计分析软件进行差异显著性分析，采用Origin 9.1软件、Prism 8.0、RStudio 2019作图，差异显著性水平为p＜0.05。

2 结果与讨论

2.1 得油率(%)

在提油过程中，通过4 ℃静置沉淀、离心后，得到比较稳定的粗油。乙醇提取物分成了油相和胶体相两层。由图1可知，用超声辅助正己烷提取的栀子油得率最高为14.86%，其次是乙酸乙酯（13.84%）和乙醇油相（13.26%），乙醇胶体相得率最低，为9.68%。分析表明，乙酸乙酯作为新型提油溶剂与传统的工业溶剂正己烷在得油率上并无显著差异（p＜0.05）；乙醇油相的得率略低于正己烷，但与乙酸乙酯没有显著差异（p＜0.05）。Phiwe Charles Jiyane等[19]发现在其他条件一致的情况下，乙酸乙酯提取20 min可得最大得油率，而正己烷提取仅需6 min且得率更高。有研究表明超声辅助提取可以缩短提取时间，提高油脂得率[7,20]，因此该实验在没有超声辅助时与本实验结果有所差异。乙醇已被用于咖啡油[21]、芝麻油[22]、萝卜种子油[23]的提取中。在提取过程中，使用乙醇能减少溶剂使用量，同时增加提取速率，因此乙醇提油被当作一种新的绿色油脂提取技术。本文用乙醇提栀子果油也有副产物产生，而这些醇溶性的成分有很高的抗氧化能力，因此需评估这三种溶剂提取物的生物活性成分以及其与抗氧化的相关性，综合分析选择可以代替工业溶剂的有机溶剂。

图1 栀子果不同有机溶剂超声提取物得率Fig.1 Ultrasonic extraction yield of gardenia fruit with different organic solvents

2.2 自由基清除能力

表1 不同有机溶剂超声提取物IC50值Table 1 The IC50 value of DPPH and ABTS scavenging rate in different extraction

图2 不同有机溶剂超声提取物ABTS自由基清除能力(a～c)及DPPH自由基清除能力(d～f)Fig.2 ABTS (a～c) and DPPH (d～f) free radical scavenging capacity of different extraction

与参考化合物槲皮素相比，提取物具有剂量响应的ABTS自由基清除活性，在最高测试浓度（20 mg/mL，图2a～c）下观察到最高活性。乙醇提取出的副产物ECP的ABTS自由基清除活性（IC50=0.40 mg/mL，表1）极显著（p＜0.01）高于粗油的ABTS清除活性（IC50=7.60～9.39 mg/mL）。

与参考化合物槲皮素和抗坏血酸相比，提取物具有剂量响应的DPPH自由基清除活性，在最高测试浓度（20 mg/mL，图2d～f）下观察到最高活性。乙醇提取出的副产物ECP的DPPH自由基清除活性（IC50=0.61 mg/mL，表1）极显著（p＜0.01）高于粗油的DPPH清除活性（IC50=8.38～10.31 mg/mL）。

Lee等人[24]研究表明栀子果乙醇提取物显示出极佳的DPPH自由基清除活性（IC50=38.46 μg/mL），其结果远小于本实验，可能是因为该实验栀子果乙醇提取时间长达24 h且提取物经过了减压蒸发浓缩。Savic等人用不同有机溶剂提取李子籽油[25]，DPPH自由基清除实验IC50值显示抗氧化活性降低顺序为：氯仿:甲醇(2:1V/V)≈丙酮＞正己烷＞正庚烷＞乙酸乙酯，得出溶剂极性越大，提取出油的抗氧化活性越高的结论。本实验乙醇胶体相显示出极低的IC50值可能是由于乙醇的极性较高，且是总酚、黄酮类、缩合单宁或原花色素等抗氧化活性物质的良好溶剂[26]。此外，粗油中不饱和脂肪酸组成、甾醇含量、生育酚含量是常见的影响油本身抗氧化能力强弱的因素[9]。两个自由基清除实验结果表明，乙醇胶体相中可能存在一些醇溶性的抗氧化活性成分。

2.3 活性成分含量

2.3.1 脂肪酸图谱

由表2可知，3种有机溶剂提取的脂肪酸组成成分基本相同，其链长从C-16至C-23，以不饱和脂肪酸顺式亚油酸（18:2，41.58%～42.90%）、油酸（18:1，34.15%～35.95%）为主，而饱和脂肪酸中棕榈酸（16:0）是主要成分。李昊阳等人[6]用正己烷、亚临界和超临界法萃取栀子果油，检测出6种脂肪酸，主要是油酸和亚油酸，其中不饱和脂肪酸含量为76.04%～78.00%，本文实验中还检测出花生酸、山嵛酸等脂肪酸组成成分，且不饱和脂肪酸含量为80.93%～81.20%，这可能表明超声辅助溶剂提取油脂方法更易于油脂溶出，提高提取效率。不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比例（P/S）是评估油质量最重要的指标之一，P/S越大，油的质量越好[27]。据表2显示，乙醇提取的粗油P/S为4.31，而正己烷仅为4.24，说明乙醇提油油质显著（p＜0.05）优于正己烷，其原因可能是不同的萃取溶剂对脂肪酸与甘油酯的选择性不同。乙醇和乙酸乙酯提取物中存在γ-亚麻酸（1.50%），乙醇的副产物中还检出了反式亚油酸（1.14%，如图3d左侧箭头所示）。亚油酸和亚麻酸是人和动物营养中必需的脂肪酸，可以降血脂、防血栓，同时它们又是体内合成ARA、DHA、EPA的前体物质[28-30]，对于人体健康十分有益。因此，相比于正己烷和乙酸乙酯，乙醇是一种提取栀子果油的理想溶剂。

2.3.2 酚酸含量

由表3可知，正己烷提取的粗油中，只有对羟基肉桂酸和芥子酸有响应值，其浓度分别为0.46 µg/g和2.80 µg/g，表明用正己烷提取油是不利于酚酸从栀子果中分离的。在被精确定量的十种酚酸中，阿魏酸和丁香酸在乙醇提取的粗油中有较高的响应值，分别为248.79 µg/g和207.96 µg/g。丁香酸易挥发且有独特芳香气味，因此其可能是导致这两种粗油与正己烷提取的粗油在嗅觉上存在差异的主要原因。有研究表明栀子花的主要挥发性化学芳香成分为法尼烯，z-3-己烯酸酯，z-3-己烯苯甲酸酯，吲哚[31]，但乙醇提取栀子果油的芳香气味可能主要来源于丁香酸。乙酸乙酯有很强的刺激性气味，用乙酸乙酯提取栀子果油会在嗅觉上产生不愉悦感。在总酚含量上，乙醇提取副产物（1174.32 µg/g）显著（p＜0.05）高于乙酸乙酯（124.59µg/g）和正己烷（3.25 µg/g），由于离心分离，酚酸大都集聚到乙醇胶体相中，这十分符合酚酸醇溶性的特征。Trishna Debnath等人研究栀子果提取物中的抗氧化活性，得出抗氧化剂活性与总酚和类黄酮含量相关[32]，Biglari等人[33]的研究亦证实，栀子果的醇提物和水提物中酚类和类黄酮含量均比一些常见的新鲜或干燥的水果（比如Phoenix dactylifera）强，可作为天然抗氧化剂和膳食补充剂。

图3 不同有机溶剂超声提取栀子果油气相色谱图Fig.3 Fatty acids GC profiles of different extraction

表2 不同有机溶剂超声提取物脂肪酸图谱Table 2 Fatty acids profiles of different extraction

表3 不同有机溶剂超声提取物酚酸组成和含量Table 3 Phenolic acid profile in different extraction

2.3.3 西红花酸及其衍生物含量

以Crocetin，CrocinⅠ，CrocinⅡ作为液相外标，定量分析粗油及副产物西红花素及其衍生物含量，发现乙醇胶体相中有多个出峰并不能被合理解释。UPLC-Triple-TOF/MS质谱分析结果显示保留时间为12.0713 min（对应液相9.646 min），16.1819 min（对应液相13.54～13.55 min），17.3975 min（对应液相14.53 min），24.0474 min（对应液相21.482～21.486 min）的准分子离子[M-H]-为m/z651.26，[M+CH3COOH]-为m/z711.32。对其进行碰撞诱导解离，在二级质谱图中，可观测系列脱糖碎片峰m/z489[M-H-Glc]-、m/z327[M-H-Glc-Glc]-等碎片离子，该化合物的母核准分子离子为m/z327，结构中存在2个葡萄糖。推测该化合物可能为母核是类似西红花酸的结构，且存在顺反异构，单侧带双糖，或者双侧带单糖。

保留时间为18.6372 min（对应液相15.96～15.961 min）的准分子离子[M-H]-为m/z813.31，[M+Cl]-为m/z849.29。对其进行碰撞诱导解离，在二级质谱图中，可观测系列脱糖碎片峰m/z651[M-H-Glc]-、m/z489[M-H-Glc-Glc]-、m/z327[M-H-Glc-Glc-Glc]-等碎片离子，该化合物的母核准分子离子为m/z327，推测该化合物可能为母核是类似西红花酸的结构，并在双侧一共携带3个葡萄糖分子，为CrocinⅡ的同分异构体。

保留时间为20.5137 min（对应液相17.749～17.751 min）的准分子离子[M-H]-为m/z489.21，[M+COOH]-为m/z535.22，[M+COONa]-为m/z558.20。对其进行碰撞诱导解离，在二级质谱图中，可观测脱糖碎片峰m/z327[M-H-Glc]-等碎片离子，推测该化合物可能为母核是类似西红花酸的结构，并在一侧携带1个葡萄糖分子的西红花酸衍生物。

在乙酸乙酯的粗油提取物中仅检测到少量西红花酸（5.39±0.40 µg/g），但在乙醇胶体相中其含量非常丰富（p＜0.01），总量达到了31065.57 µg/g，远大于标定的十四种酚酸的总含量，因而大量存在于乙醇胶体相中的醇溶性抗氧化活性物质可能为西红花酸及其衍生物。西红花苷是红花酸与不同糖结合而成的一系列酯苷，由于双侧带糖多羟基结构而易溶于水。在乙醇提油过程中由于加热以及相似相溶原理被大量溶出，后因乙醇蒸发且粗油冷却形成胶体相析出。Yang等人用UPLC-Q/TOF-MS色谱分析结合HRESIMS、UV/vis、一维二维氢谱，鉴定出包括B-J(1-9)和13-cis-crocetin-8′-O-β-D-gentiobioside十种新的西红花酸及其衍生物，与本实验结果十分类似[34]。

图4 乙醇胶体相在吸收波长为440 nm通道下UPLC-Triple-TOF/MS色谱图Fig 4 The UPLC-Triple-TOF/MS graph of ECP sample in A440 nm channel

表4 不同有机溶剂超声提取物西红花酸及其衍生物含量Table 4 Crocetin and its derivative in different extraction

表5 乙醇胶体相中的西红花酸衍生物质谱数据Table 5 Mass spectrometric data of main crocetin derivative in ECP

表6 不同有机溶剂超声提取物生育酚含量Table 6 Tocopherol profiles of different extraction

表7 不同有机溶剂超声提取物甾醇含量Table 7 Phytosterol profile of different extraction

2.3.4 生育酚含量

图5 生育酚标品和栀子果提取物在激发波长为295 nm，吸收波长为330 nm时液相色谱图Fig.5 The HPLC (FLD) graph of 3 standard tocopherol samples and Gardenia fruit extractat an excitation wavelength of 295 nm and emission wavelength of 330 nm

由表6不难发现，乙醇提取的粗油中总生育酚含量为1.62 µg/mg，显著高于（p＜0.05）乙酸乙酯（1.42µg/mg）和正己烷（1.27 µg/mg）。其中，α-生育酚是栀子果油的主要成分（0.76～0.81 µg/mg），占总生育酚的50%以上。Imsanguan[35]等人研究表明乙醇和己烷均不能从米糠中萃取α-生育酚，这是因为米糠中的α-生育酚为基质形式，低压（即大气压）下的提取不足以消除蛋白质、不溶于水的碳水化合物等其他分子的干扰。本实验可能是由于用超声辅助溶剂提取，促进了栀子果粉末细胞破裂，增强α-生育酚跨细胞膜传送速率，因而在常压下萃取出了α-生育酚。在乙醇提取的粗油以及副产物中，γ-生育酚的含量（0.26～0.30µg/mg）显著高于（p＜0.05）乙酸乙酯和正己烷提取的粗油中的含量，这些可能都由于生育酚有较长的侧链，乙醇对其的萃取能力高于正己烷和乙酸乙酯。近期研究表明[36]，γ-生育酚可能是亲脂性亲电试剂更有效的捕集剂，对人体健康的影响可能比α-生育酚更为重要。因此，乙醇提取栀子果油可能具有更高营养价值。

2.3.5 甾醇含量

图6 4种植物甾醇标品气相质谱图Fig.6 The GC-MS graph of 4 standard phytosterol samples

GC-MS定量结果表明不同有机溶剂提取物中存在9种甾醇，按出峰顺序分别为谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、真菌甾醇、钝叶醇、β-谷甾醇、异岩藻酯醇、环烷醇、环烯醇（表7）。β-谷甾醇是栀子果油中最丰富的甾醇，其次是菜油甾醇，环烯醇和豆甾醇。其中，环烯醇可作为一种补虚通乳，排脓解毒的药物，在一般的粗油品中较为少见[37]，因此其可能成为栀子果油的特色功能成分。乙醇提取粗油中总甾醇含量为22.63µg/mg，显著（p＜0.05）高于乙酸乙酯提取油（17.50µg/mg），但与正己烷提取油并无显著（p＜0.05）差异。此外，乙醇提取粗油中9种甾醇含量均为最高（除了环烷醇未检出），表明乙醇比正己烷、乙酸乙酯更易于提取植物甾醇。

2.4 栀子果油提取物中活性成分含量与抗氧化活性双变量相关性分析

图7 栀子果油提取物中活性成分含量与抗氧化活性双变量相关性分析R图Fig.7 The correlation analysis of active components in gardenia fruit oil extract and its antioxidant activity by bivariate R chart

Pearson模型适用于分析两连续数值型变量之间的线性相关关系，因此，利用SPSS 20软件对不同栀子果油提取物中西红花酸及其衍生物、植物甾醇、生育酚、酚酸含量、不饱和脂肪酸/饱和脂肪酸比例（P/S）与抗氧化活性（DPPH·、ABTS+·清除能力，以IC50值表示）进行双变量相关性分析，结果如图7所示。DPPH·清除能力、ABTS+·清除能力的IC50值呈极显著相关（p＜0.01），可能是由于DPPH·和ABTS+·两种抗氧化检测方法都是基于单电子转移机制，因此测定结果间的相关性很高。

抗氧化活性物质彼此之间的正负相关性则体现了活性物质溶解性之间的差异。在用乙醇提取栀子果油的ECP相中，溶剂是旋蒸未完全除尽的乙醇和栀子果实中的结合水，因此易溶于水的西红花酸及其衍生物、酚酸更易溶解在此相中，而脂溶性的植物甾醇和生育酚更易溶解在油相中。因而在栀子果油提取物中水易溶的活性物质与脂易容的活性物质彼此间呈现负相关。

DPPH·清除能力、ABTS+·清除能力的IC50值与酚酸含量间均成极显著负相关，与西红花酸及其衍生物间成显著负相关，说明栀子果油提取物中，酚酸、西红花酸及其衍生物的含量越高，IC50值越低，自由基清除能力越强。而植物甾醇、生育酚、不饱和脂肪酸/饱和脂肪酸比例（P/S）在各种栀子果提取物中，并不是影响DPPH·和ABTS+·自由基清除能力的主要因素。这可能是由于酚酸类物质的多羟基结构和西红花酸及其衍生物共轭双键的作用。

3 结论

本研究表明不同的提取溶剂会影响栀子果油的得率、脂质组成、植物活性物质和体外抗氧化能力。栀子果油中的单不饱和脂肪酸（MUFA）和多不饱和脂肪酸（PUFA）含量极高，尤其是亚油酸和油酸，而乙醇还可将其中的γ-亚麻酸成分提出。不同的有机溶剂对植物化学物质（酚酸、生育酚、植物甾醇和西红花酸及其衍生物）的含量有显著影响（p＜0.05），乙醇提取粗油中酚酸，生育酚和植物甾醇含量较高，因此可能具有更高的生物活性。此外，乙醇提取油的副产物胶体相中含有大量的与体外抗氧化活性（DPPH、ABTS）显著相关的西红花酸及其衍生物，这又进一步提高了乙醇提取栀子果油的经济价值。