刘 杰，刘 刚，李姝洁，邓子昂，欧全宏，时有明

(1.云南师范大学物理与电子信息学院，昆明 650500；2.曲靖师范学院物理与电子工程学院，云南 曲靖 655011)

水稻是人类最重要的粮食作物。水稻种子在贮存过程中伴随着老化的发生，理化性质也会发生很大的变化[1]。种子老化会引起种子体内贮藏物质下降，有毒物质累积，细胞结构破坏，生理代谢紊乱[2]，从而导致发芽延迟，发芽率降低和种子活力显著丧失，严重影响种子生产和食品安全[3]。因此，检测水稻种子的老化程度，对水稻种子的农业生产及食品安全具有重要意义。

传统种子老化检测方法是依据气味、色泽等指标进行评判，具有一定的主观性；常规方法包括标准发芽试验、电导率试验、幼苗生长试验、低温发芽试验和四唑染色测定等，不仅耗时且具有破坏性，并需要一定的训练经验[5]。新型检测技术中，Yan等[5]基于气相色谱串联质谱法探索自然储存条件下两种杂交水稻种子之间的代谢组差异，对种子贮存性进一步了解。高艳琪等[6]基于近红外光谱和人工神经网络建立检测模型，可对老化水稻种子达到准确检测。吴小芬等[7]基于两种老化的水稻种子，利用高光谱成像和化学计量学方法检测种子的活力。Fang等[8]利用红外热成像技术和广义回归神经网络技术建立模型，检测老化水稻种子的发芽率。李欢欢等[9]采用光声光谱技术结合LS-SVR建立模型对稻种活力进行较好预测精度的测定。Hassan等[10]利用基于气态传感的电子鼻技术追踪香稻米和非香稻米存储过程中香气的变化，对水稻种子的老化过程进行评估。这些无损技术在应用过程中都存在一定的缺点，如近红外光谱技术(NIR)和高光谱成像(HIS)或多光谱成像(MSI)的缺点是每种样品都需要一个新的校准模型，校准模型需要收集大量数据集，预测精度取决于多种外界因素；光声光谱技术操作比较复杂，需要专门的训练经验；气相色谱串联质谱法的预处理复杂且价格高昂；电子鼻技术需要重复建模，工作量较大；红外热成像(IRT)在种子质量评估中应用成本高，检测效率低等[5]。

FT-IR是一种快速无损的技术，具有从宏观上识别整个复杂系统的优势[11]。SD-IR用来提高光谱的分辨率[12]，利用二维相关红外光谱(2 D-IR)通过温度微扰对各组分基团分子的振动行为进行分析[13]。红外光谱技术已用于农作物种子检测[14]。Genkawa等[15]利用傅里叶变换红外光谱(FTIR)结合二阶导数光谱并基于二阶导数建立回归曲线，计算水稻储存过程的游离脂肪酸的变化。Wu等[16]基于傅里叶变换红外光声光谱法(FTIR-PAS)记录水稻叶片的光谱，有效诊断水稻氮素营养状况。Priyanka等[17]利用ATR-FTIR光谱法对水稻种子中的官能团进行检测，基于激光烧蚀-电感耦合等离子体质谱法(LA-ICP-MS)定量测定水稻种子横截面中Zn、As、Cd、Pb和Sb等元素在空间水平上的分布。杨卫梅等[14]利用傅里叶变换红外光谱结合二维相关红外光谱快速有效的对自然老化下的谷类种子进行区分。

本研究采用高温高湿法对楚粳29号和楚粳40号水稻种子进行人工加速老化处理，利用傅里叶变换红外光谱(FT-IR)、二阶导数红外光谱(SD-IR)结合二维相关红外光谱(2 D-IR) 研究人工老化水稻种子，以期建立一种有效、快速检测水稻种子老化的方法。

1 材料与方法

1.1 仪器和参数

美国Perkins Elmer公司生产配备DTGS探测器的Frontier型傅里叶变换换红外光谱仪，测定范围4 000～400 cm-1，扫描次数16，分辨率为4 cm-1。Eurotherm公司生产的SYD-TC-01型温度控制仪，在50～120 ℃范围内每隔10 ℃采集一次光谱。

1.2 样品制备

供试水稻种子为2019年收获的楚粳29号和楚粳40号，挑选颗粒饱满、无霉变、大小形状基本相同的种子。设置LS-150 S种子老化箱的温度为45 ℃，湿度为95%，将每个品种种子随机分成5组，放入老化箱内。分别在老化2 d、4 d、6 d、8 d、10 d各取出一组水稻种子，得到未老化、老化2 d、4 d、6 d、8 d、10 d等6组试验水稻种子样品。老化处理后的水稻种子放置于室温下晾晒，晒干后放入密封袋冷藏备用。

1.3 红外光谱采集

将人工老化水稻样品和溴化钾分别研磨成细粉，以一定的比例混合，研磨均匀后进行压片测量，扣除溴化钾背景。

光谱采集使用Spectum 10软件，对原始IR光谱进行13点平滑后获得SD-IR光谱。使用由清华大学化学系编程的2 D-IR相关分析软件，对在50～120 ℃每隔10 ℃采集得到的动态光谱进行处理，获得2 D-IR光谱。

2 结果与讨论

2.1 傅里叶变换红外光谱分析

图1和图2为人工老化楚粳29号和楚粳40号水稻种子的傅里叶变换红外光谱。从图中可知，人工老化楚粳29号水稻种子的傅里叶变换红外光谱整体相似；人工老化楚粳40号水稻种子的傅里叶变换红外光谱整体相似；两种水稻种子在老化过程中的傅里叶变换红外光谱整体相似。表1是人工老化楚粳29号和楚粳40号水稻种子在傅里叶变换红外光谱中出现的特征峰，由表可知水稻种子在人工老化过程中吸收峰没有明显差异。因此，对人工老化水稻种子的研究，需进一步的分析。

表1 水稻种子的傅里叶变换红外光谱吸收峰Table 1 Absorption peaks of rice seeds by Fourier transform infrared spectroscopy

2.2 二阶导数红外光谱分析

老化水稻种子原始红外光谱差异不大，而导数光谱具有更高的分辨率，能够显示更多的分子信息。选用Savitsky-Golay方法，对老化水稻种子样品的红外光谱进行二阶导数处理。

图3是人工老化楚粳29号水稻种子在1 800～800 cm-1范围内的二阶导数红外光谱。水稻种子在1 745 cm-1附近的吸收峰强度随老化程度增加呈增强的趋势，在老化4 d和老化6 d时出现一定下降，在老化10 d时增至最强。在1 658 cm-1附近的吸收峰强度呈先增强后减弱的趋势，在老化6 d增至最强，老化10 d的强度最弱。在1 548 cm-1附近的吸收峰强度呈减弱趋势，在老化2 d时出现一定增强。在1 209 cm-1附近的吸收峰强度呈减弱的趋势，在老化4 d时出现一定增强，老化4～10 d呈连续下降趋势。人工老化水稻种子在1 466、1 379 cm-1附近的吸收峰随着老化程度的增加呈增强趋势。在1 417、1 338、1 109、922、861 cm-1附近的吸收峰强度随着老化程度的增加呈先增强再减弱的趋势。

图4为人工老化楚粳40号水稻种子在1 800～800 cm-1范围内的二阶导数红外光谱。人工老化楚粳40号水稻种子在1 657 cm-1附近的吸收峰强度呈先增强再减弱的趋势，在老化4 d时增至最强，老化10 d时强度最弱。在1 305 cm-1附近的吸收峰强度随着老化程度增加呈增强趋势，在老化8 d时出现一定下降趋势，老化10 d时吸收峰强度最强。1 339、1 020、986、861 cm-1附近吸收峰强度呈增强趋势。1 209、1 122、1 109、922 cm-1范围内吸收峰强度随老化程度的增加呈先减弱再增强的趋势。1 379、1 082 cm-1附近吸收峰强度随老化程度的增加呈先增强再减弱的趋势。

综上所述，老化水稻种子在1 745 cm-1附近的吸收峰强度随着老化程度的增加而增强，表明水稻种子中的脂类物质在随着老化程度的增加而增加；在1 548 cm-1附近吸收峰强度发生明显的减弱，表明水稻种子中蛋白质随着老化过程的增加而减少；在1 209 cm-1附近的吸收峰强度在减小，表明水稻种子中的糖类物质在随着老化程度的增加而减少。

2.3 二维相关红外光谱分析

二维相关红外光谱(2 D-IR)受温度扰动产生光谱强度的变化，获得更多的动态结构信息[12]。对楚粳29号和楚粳40号人工老化水稻种子进行二维相关红外处理，为水稻种子老化检测提供依据。

图5是人工老化楚粳29号水稻种子在800～1 350 cm-1范围内的二维相关红外光谱。未老化和老化水稻种子在800～1 350 cm-1范围内均出现6个强自动峰，分别出现在837、879、945、1 066、1 139、1 224 cm-1附近。未老化、老化2 d、老化4 d、老化8 d的最强峰出现在879 cm-1附近，老化6 d的在1 221 cm-1附近表现为最强峰，老化10 d的水稻种子的最强峰出现在879 cm-1和1 224 cm-1附近。未老化水稻种子在945 cm-1和1 139 cm-1处自动峰表现相同的强度；老化后水稻种子，水稻种子在1 139 cm-1附近的自动峰强度高于945 cm-1处。水稻种子在834、1 066、1 139 cm-1附近的自动峰，在老化6 d时处表现为最强，在老化4 d时表现为最弱。

图6为人工老化楚粳40号水稻种子在800～1 350 cm-1范围内的二维相关红外光谱。未老化和老化楚粳40号水稻种子均出现了6个强自峰，分别出现在836、879、945、1 066、1 139、1 224 cm-1附近。未老化、老化2 d、老化10 d水稻种子的最强峰出现在879 cm-1处，老化4 d的最强峰出现在885 cm-1，老化6 d的最强峰出现在885 cm-1和1 223 cm-1附近，老化8 d最强峰出现在1 223 cm-1处。未老化水稻种子在945、1 066 cm-1处自动峰表现相同的强度；老化4 d和老化10 d水稻种子在945 cm-1附近的自动峰强度高于1 066 cm-1处；老化2 d，老化6 d及老化8 d水稻种子在945 cm-1附近自动峰强度弱于1 066 cm-1处。1 066 cm-1和1 137 cm-1处的自动峰在未老化水稻种子处表现最弱，在老化8 d处表现最强。

3 结 论

利用傅里叶变换红外光谱、二阶导数红外光谱和二维相关红外光谱研究人工老化的两种水稻种子。结果表明，在原始光谱中，人工老化水稻种子的光谱整体相似；两种水稻种子老化过程的原始光谱整体相似。二阶导数红外光谱分析显示，老化水稻种子吸收峰的位置和强度表现出差异；两种老化水稻种子光谱显示出差异，在楚粳29号水稻种子中，老化水稻种子吸收峰差异表现较为明显，在楚粳40号水稻种子中吸收峰差异表现较为复杂。在800～1 350 cm-1范围内对老化水稻种子进行二维相关分析，未老化和老化水稻种子的差异较为明显，老化后水稻种子的自动峰强度表现出差异，最强峰的位置和强度发生改变；两种水稻中在自动峰强度变化表现出差异，楚粳29号水稻种子在老化10 d处变化较为明显，楚粳40号水稻种子在老化6 d处变化较为明显。结果表明，红外光谱法可以快速、有效地区分不同老化程度的水稻种子，可以对不同品种的老化水稻种子进行一定的区分。但是，对不同品种水稻种子差异变化，还有待更进一步的研究。