薛芸霞 刘俊 李志杰

暨南大学眼表疾病国际协同创新研究中心 再生医学教育部重点实验室，广州 510632

角膜约占整个视觉系统屈光力的1/3，其正常结构和透明状态的维持是正常视觉功能的重要保障[1-3]。然而，由于角膜直接暴露于外界环境，易受到各种外来因素的刺激，如感染、机械性和化学性外伤等。不同的外来刺激均可造成角膜发生不同程度的炎症反应。角膜的炎症反应是一种复杂的级联过程，涉及不同的免疫细胞，其中嗜中性粒细胞是炎症反应中最先募集到炎症部位的细胞，在炎症反应中的作用非常复杂，其一方面可通过释放预先合成的酶类物质和自由基类分子杀伤入侵的微生物，另一方面也可通过产生不同种类的细胞因子促进创面的修复。因此，定量分析角膜炎症状态下嗜中性粒细胞在角膜中的数量和性质极其重要。目前检测角膜组织炎症反应中嗜中性粒细胞的技术和方法较多，主要包括角膜组织切片、整铺片和检测炎症角膜中嗜中性粒细胞相关酶类物质的浓度[4-6]，这些技术各有优缺点。整铺片和组织学方法可观察浸润嗜中性粒细胞在角膜中的组织学定位，而电子显微镜下可观察嗜中性粒细胞的超微结构及其与其他细胞之间的关系。如何检测和定量分析角膜中嗜中性粒细胞的数量具有重要意义。流式细胞术是利用流式细胞仪同时对单个细胞的多个参数进行定性和定量分析的生物医学分析技术，具有检测速度快、通量高、灵敏度高、采集数据量大、节约样本及成本的优点，已广泛应用于临床样本检测[7]。但目前用于检测各种炎症状态下角膜组织中嗜中性粒细胞的技术方法鲜见文献报道。本研究建立一种基于流式细胞术快速定量分析小鼠角膜中嗜中性粒细胞的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 选取6～8周龄健康无眼疾SPF级雌性C57BL/6小鼠21只，购于广东省医学实验动物中心。实验动物的使用和喂养遵循美国视觉与眼科学研究协会制定的科研动物使用规范，本研究方案经暨南大学实验动物伦理委员会审核批准(批文号：JN-A-2002-01)。

1.1.2主要试剂及仪器 苯巴比妥钠注射液(上海碧云天生物技术有限公司)；磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)(美国GE Healthcare公司)；胶原酶Ⅰ、DNA酶(美国Sigma公司)；体积分数10% Triton X-100透膜液、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)(广州斯佳生物技术有限公司)；流式染色缓冲液(美国Thermo Fisher Scientific公司)；抗小鼠CD16/32抗体(美国R&D Systems公司)；APC标记抗小鼠CD45-抗体、FITC标记抗小鼠Ly6G-抗体、Percp-Cy5.5标记抗小鼠CD11b-抗体(美国BD Biosciences公司)；多聚甲醛(广州化学试剂厂)。FACSCanto流式分析仪(美国BD Biosciences公司)；正置荧光显微镜(BX53，日本Olympus公司)；体式显微镜(GL-99BI，桂林桂光仪器公司)；高尔夫样刀(美国Accutome公司)。

1.2 方法

1.2.1小鼠角膜组织中嗜中性粒细胞的流式细胞术分析检测 (1)实验动物处理 按照文献[8]描述的方法进行，取15只小鼠腹腔内注射苯巴比妥钠25～50 mg/kg将小鼠麻醉后，使用直径2 mm的环钻标记角膜中央区域，并采用高尔夫样刀机械性刮除已标记的中央区角膜上皮细胞层。注意此过程中避免伤及角膜基质层。(2)角膜取材 创伤后18 h处死小鼠，摘出眼球置于无菌PBS中，于体式显微镜下修剪得到含完整角膜缘的角膜组织，将角膜组织转移至1.5 ml无菌EP管中，并使用剪刀快速将组织充分剪碎(图1)。(3)胶原酶消化 向剪碎后的角膜组织中加入100 μl质量分数4%的胶原酶Ⅰ和1 ml无菌PBS，再加入2 μl DNA酶防止组织在消化过程中成团，然后置于37 ℃水浴锅中消化30 min，每隔15 min震荡摇匀1次，充分消化后将细胞混悬液转移至10 ml无菌离心管中，加入8 ml无菌PBS，400×g离心5 min，弃上清，加入1 ml流式染色缓冲液重悬细胞并使用200目筛网过滤，离心收集细胞沉淀(图1)。(4)抗体孵育 使用200 μl流式染色缓冲液重悬细胞后加入2 μl抗小鼠CD16/32抗体，室温下孵育10 min封闭抗原，随后分别加入2 μl抗小鼠CD45、Ly6G和CD11b抗体，室温下避光孵育30 min，加入PBS洗涤，400×g离心5 min后弃上清，加入400 μl PBS重悬细胞，过流式筛管后上机测试。注意避光，如需过夜则需加入400 μl质量分数1%多聚甲醛并置于4 ℃保存，过流式筛管后上机检测。(5)流式细胞仪检测 单个角膜的细胞量不足以支撑流式细胞仪筛选，根据我们前期实验1个流式样品至少需要5只小鼠10只角膜一起剪碎消化完成后获取的细胞量，将5只小鼠10只角膜合并进行流式细胞仪筛选。先将同型对照样品上机划门，随后将目标样品上机进行检测，分析阳性区域的细胞百分数。

图1 流式细胞术检测角膜组织样本中嗜中性粒细胞的操作流程 A：取眼球 B：获取角膜 C：将角膜剪成梅花状并转移至离心管机械性剪碎 D：加入PBS、DNA酶和胶原酶I E：消化完成后过筛重离心Figure 1 Operational flowchat of neutrophils detection in corneal tissue samples by flow cytometry A：Enucleate the eyeballs B：Obtain the corneas C：Cut the corneas into plum blossom shape and transfer them to the centrifuge tube for mechanical shearing D：Add PBS，DNase and collagenase I E：After digestion and sieving，obtain the single cell suspension via centrifugation

1.2.2小鼠角膜整铺片及免疫荧光染色 取6只小鼠，应用随机数字表法分为创伤组和正常组，每组3只。参照文献[9-14]的方法，采用颈椎脱臼法处死小鼠，摘取眼球并置于2%多聚甲醛中固定40 min，解剖显微镜下修剪眼球获取含有完整角膜缘的角膜组织，PBS冲洗5 min，共3次，然后置于500 μl质量分数2%BSA封闭液中封闭15 min，1%Triton X-100透膜液中透膜15 min，加入2 μl抗小鼠FITC标记的Ly6G抗体4 ℃孵育过夜，PBS冲洗5 min，共3次，角膜上皮面朝上呈梅花状置于载玻片，滴加含有DAPI的封片剂封片，4 ℃避光保存。

1.2.3小鼠角膜组织中嗜中性粒细胞的定量分析 参照文献[9-14]的方法，至少选取4～6个角膜，在400倍镜下，角膜缘任意选取8个目标视野并拍照计数，取其平均值作为募集的嗜中性粒细胞数量，分析并比较正常角膜和创伤后18 h角膜组织中募集嗜中性粒细胞数量的差异。

1.3 统计学方法

采用SPSS 21.0统计学软件(美国IBM公司)和GraphPad Prism 6.0软件(美国Graph-Pad公司)进行统计分析。计量资料的数据经W检验证实呈正态分布，以mean±SD表示。创伤后18 h与正常角膜的角膜缘募集嗜中性粒细胞的数量比较采用独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 上机测试获得角膜组织中嗜中性粒细胞的定量分析

上机测试完成后，原始数据进行去细胞碎片处理，并进行单细胞筛选，进而画门筛选出CD45+细胞占角膜组织所有细胞的比例为(20.93±1.72)%，并获取Ly6G+和CD11b+细胞在CD45+细胞中所占比例分别为(75.50±3.25)%和(93.40±4.53)%，进一步画门筛选出Ly6G+和CD11b+共阳性细胞占角膜组织所有CD45+阳性细胞的比例为(67.33±2.80)%(图2)。

图2 流式细胞术检测角膜组织中嗜中性粒细胞的定量分析 A：去掉细胞碎片 B：去黏连得到单细胞 C：CD45+细胞分析 D：Ly6G+和CD11b+共阳性细胞定量分析 SSC-A：侧向散射光面积；FSC-A：前向散射光面积；FSC-H：前向散射光高度；SSC-W：侧向散射光宽度；CD45-APC：CD45染色白细胞；Ly6G-FITC：Ly6G和CD11b共同染色嗜中性粒细胞Figure 2 A quantitative analysis of neutrophils in the corneal tissue samples by flow cytometry A：Remove cell debris B：Obtain the single cell suspension C：Analyze CD45+cell subset D：Gate and analyze the Ly6G+ and CD11b+ double positive cell subset SSC-A：side scatter-area；FSC-A：forward scatter-area；FSC-H：forward scatter-height；SSC-W：side scatter-width；CD45-APC：allophycocyanin (APC)-conjugated anti-mouse CD45 antibody；Ly6G-FITC：fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated anti-mouse Ly6G antibody

2.2 免疫荧光染色观察正常和创伤角膜的嗜中性粒细胞数量变化

正置荧光显微镜下获取角膜缘Ly6G+细胞图片并进行计数，结果显示创伤后18 h角膜中角膜缘募集嗜中性粒细胞数量为(151.47±10.82)%，明显多于正常角膜的(15.36±1.02)%，差异有统计学意义(t=21.689，P<0.01)(图3)。

图3 免疫荧光染色观察角膜组织中嗜中性粒细胞的数量 A：正常角膜的角膜缘Ly6G抗体免疫荧光染色图片，红色虚线标记角膜缘血管位置(×400，标尺=50 μm) B：创伤后18 h角膜的角膜缘Ly6G抗体免疫荧光染色图片，红色虚线标记角膜缘血管位置(×400，标尺=50 μm) C：正常小鼠角膜缘和创伤后18 h角膜缘嗜中性粒细胞数量比较 与正常角膜比较，aP<0.01(独立样本t检验，n=3)Figure 3 Immunofluorescence staining to enumerate the number of neutrophils in the corneal limbus A：Representative image of FITC-anti-Ly6G+ neutrophils in the normal corneal limbus，the red dotted lines marked the position of the limbus blood vessel (×400，bar=50 μm) B：Representative image of FITC-anti-Ly6G+ neutrophils in the corneal limbus at 18 hours after corneal abrasion，the red dotted lines marked the position of the limbus blood vessel (×400，bar=50 μm) C：Comparison of the numbers of limbal neutrophils in the normal mice cornea and wounded cornea at 18 hours after corneal abrasion，aP<0.01 (Independent-samples t test，n=3)

3 讨论

许多因素可引起角膜的炎症反应，我们实验室在过去10年间以角膜创伤修复为模型探索了角膜炎症反应的过程，取得了许多有价值的数据。但是，早期我们的数据都是基于去卷积显微镜下联合免疫荧光标记和角膜整铺片技术完成的，获得的免疫细胞种类包括嗜中性粒细胞、血小板、肥大细胞、巨噬细胞、γδT细胞、自然杀伤细胞和自然淋巴样细胞[10-18]。然而，该技术因在显微镜下进行人工计数，耗费大量的人力和时间[19-20]。2015年，我们开始尝试使用流式细胞术来完成该工作，并取得了许多经验。

由于正常角膜中免疫细胞数量处于较低的休眠状态，同样的条件下流式细胞仪检测出来的数量大多具备参考性，另本研究旨在为角膜免疫细胞的研究提供新的方法，因此并没有观察不同时间角膜组织中嗜中性粒细胞的比例。在具体操作中我们发现下述几种因素影响结果的稳定性：(1)双酶联合使用 在消化标本过程中常出现细胞成团现象，双酶联合消化方法可解决这一问题；(2)样本消化时间 样本消化的时间需要控制在合理的范围内，消化时间过短影响细胞总量，消化时间过长影响细胞状态并易造成非特异性染色；(3)保留完整的角膜缘 角膜缘是炎症细胞从角膜缘血管网向角膜中央发生募集的部位，这是保证获得一致结果的重要因素；(4)充分剪碎样本 角膜组织的剪碎程度直接与获取的角膜组织细胞总量相关；(5)Fc受体的封闭 Fc受体包括FcγRⅠ、FcγRⅡ和FcγRⅢ，表达于大量免疫细胞表面。大部分所使用的抗体容易与细胞表面的Fc受体非特异性结合，造成非特异性染色。抗CD16和CD32可以分别结合FcγRⅢ和FcγRⅡ，在使用特异性抗体孵育前可使用这2种抗体降低非特异性染色。

综上所述，本研究结果显示流式细胞检测方法可快速、准确地定量分析创伤角膜中嗜中性粒细胞群，具有相对稳定、简单、实用和重复性好的特点，为进一步评价不同原因造成角膜炎症反应中嗜中性粒细胞的数量变化提供了一种快速定量分析方法。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突