响应面法优化微波萃取血红铆钉菇多糖及抗氧化活性研究

2021-02-23刘中正宋见喜姜贵全

吉林化工学院学报 2021年1期

吴也,刘中正,宋见喜,姜贵全

(北华大学材料科学与工程学院，吉林吉林 132013)

血红铆钉菇(Chroogomphidius viscidus)是铆钉菇科，红铆钉菇属，学名为红蘑，俗称松树钉、松树伞等.血红铆钉菇，初期钟形或近圆锥形，后平展，中部凸起，浅咖啡色，菌肉带红色，干后淡紫红色，近菌柄基部带黄色[1].血红铆钉菇的生长条件比较苛刻，生长在海拔 500～700 m米的阴坡中，到了夏秋季节，可在松林地上往往可见到单生或者群生的血红铆钉菇[2].在我国，血红铆钉菇主要生长于东北及河北北部地区，是东北一种珍贵的野生食用菌.其不仅口感丰富、香气迷人，也被称为“食用菌之王”，珍贵程度不亚于松茸和虫草，在西方更把它视为珍品[3].血红铆钉菇不仅味道鲜美，而且有很高的营养价值[4].研究发现，血红铆钉菇具有良好抗病毒和抗氧化能力，并且也有一定的抗肿瘤和免疫调节作用，其中最具有研究潜力的一类化学成分是多糖[5].多糖类化合物广泛存在于动植物细胞膜和细胞壁中，主要由醛基和酮基通过苷键连接的高分子聚合物，是构成生命的四大基本物质之一[6].

目前，关于血红铆钉菇多糖的提取方法主要有水提醇沉法、酶提取法、超声波提取、微波萃取等[7].微波萃取技术可有效地保护血红铆钉菇多糖中的有效成分，具有高速、高产率、高选择、低能耗、少溶剂等特点[8].响应面法是一个集试验设计、模型建立、因素影响评估、确定最佳工艺条件为一体的统计技术[9]，然而，它作为一种工具来研究和优化微波萃取血红铆钉菇的提取条件还鲜有报道.

本文以微波萃取过程中影响多糖得率的几个因素进行研究，运用响应面分析法优化血红铆钉菇的微波萃取条件.通过 Box-Beknhen 的中心组合试验设计，分析试验数据，从而得出血红铆钉菇多糖微波萃取的最佳工艺条件，得到的多糖经除蛋白后，研究其抗氧化活性，为血红铆钉菇多糖的开发及综合利用提供一定理论依据.

1 仪器与材料

1.1 试药与试剂

血红铆钉菇产自吉林通化.

95%乙醇(分析纯)天津市大茂化学试剂厂；苯酚(分析纯)天津市北方天医化学试剂厂；葡萄糖(分析纯)上海源叶生物科技有限公司；石油醚(分析纯)天津市北方天医化学试剂厂；浓硫酸(分析纯)天津市大茂化学试剂厂；DPPH试剂(分析纯)上海展华化学有限公司.

1.2 仪器与设备

FA2004N电子天平,上海菁海仪器设备制作有限公司； GZX-9146电热恒温鼓风干燥箱,上海博迅实业有限公司；HH-8电热恒温水浴锅,江苏亿通电子有限公司；CARY-5000紫外分光光度计,美国瓦里安公司；MARS6微波萃取仪,美国CEM公司；DZF-6090电热真空干燥箱,上海一恒科技有限公司；M32648九十六孔板,北京格瑞有限公司；DNM-9602A酶标仪,北京普朗有限公司.

2 方法

2.1 血红铆钉菇多糖的提取

参考侯秀娟等[10]方法：血红铆钉菇→烘干→粉碎过筛(40 目)→石油醚脱脂→加水搅匀→微波萃取→过滤→浓缩→Sevage法去蛋白[11-12]→醇沉→冷冻干燥→血红铆钉菇多糖.

2.2 血红铆钉菇多糖含量的测定

参考张媛媛等[13-14]苯酚-硫酸法，以葡萄糖为标准品，绘制标准曲线，并测定样品多糖含量.

2.2.1 苯酚溶液的配制

精确称取苯酚晶体5 g加入至100 mL容量瓶中，蒸馏水定容，配置成5%的苯酚溶液，充分摇匀后转移至棕色试剂瓶中备用.

2.2.2 葡萄糖对照样品溶液配制

精确称量葡萄糖对照样品101.00 mg，置于100 ml容量瓶中，加蒸馏水溶解并定容至刻度，充分震荡.再从容量瓶中移去10 mL置于100 mL容量瓶中，定容，摇匀备用.

2.2.3 标准曲线的绘制

精确吸取葡萄糖对照样品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.22 mL分别置于252mL比色皿中分别加水1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8 mL至2 mL，然后分别加入苯酚溶液1.6 mL摇匀震荡，迅速加入浓硫酸7.0 mL，摇匀.显色40 min；另以蒸馏水代替葡萄糖对照样品溶液，同上操作，作为空白.

用紫外分光光度计在4 902 nm波长处分别测定其吸光度.求得标准曲线回归方程为y=0.017 218x-0.022 239，R2=0.999 25，线性范围为0.01～0.05 mg/mL.

葡萄糖质量浓度(mg·mL-1)图1 苯酚硫酸法标准曲线

2.2.4 血红铆钉菇多糖含量的测定

多糖含量测定采用苯酚硫酸法[13-14]，血红铆钉菇多糖的产率按照以下公式得到

C为根据标准曲线测定得出的多糖质量浓度，mg/mL;V为血红铆钉菇多糖提取液的体积，mL;N为稀释因数;W为血红铆钉菇粉末的质量，g.

2.3 单因素试验

2.3.1 液料比对多糖产率的影响

2.3.2 微波功率对多糖产率的影响

2.3.3 微波温度对多糖产率的影响

2.3.4 微波时间对多糖产率的影响

2.4 响应面试验

在单因素实验的基础上，选取微波时间(A)、微波温度(B)、液料比(C)和微波功率(D)为因素，每个因素选取3个水平进行响应面设计试验.根据Design-Expert(8.0.6)软件中的Box-Behnken中心组合试验设计原理，以多糖产率Y(%)为响应值，设计四因素三水平响应面分析试验，得到最优的血红铆钉菇多糖提取条件.共有29个试验点，其中有24个分析因子和5个零点.零点试验共5次，用于预估误差.分别用-1、0、1对各自变量的低、中、高3个试验水平进行编码[18-20].其因素水平表如下：

表1 响应面优化设计因素水平表

2.5 血红铆钉菇多糖中的蛋白去除

具体操作步骤为：将Sevage试剂加入到4倍体积的血红铆钉菇多糖溶液中，利用磁力搅拌器充分搅拌1 h之后，置于分液漏斗中静置分层，保留上层溶液，用紫外分光光度计在波长280 nm处测定吸光度，测定蛋白的去除率[21-23].

2.6 血红铆钉菇多糖清除DPPH自由基能力的测定I

2.6.1 溶液配制

(1)取血红铆钉菇多糖样本稀释至80 mg/mL，然后倍数稀释至0.625 mg/mL，共8个浓度梯度，从低到高依次标记为1至8号.

(2)称取7.88 mg DPPH，用无水乙醇定容于100 mL容量瓶中，摇匀待用.

2.6.2 实验方法

分别称取100 μL样品加入到96孔板中，再加入DPPH溶液100 μL，样品组和对照组分别做3个平行样，充分摇匀后，用锡纸包好进行避光处理，置于25 ℃恒温箱中静置30 min.于517 nm处测得吸光度值.DPPH清除率计算公式为：

DPPH清除率(%)={1-(Ax-Ay)/A0}×100%

Ax为不同浓度样品+DPPH吸光度值;Ay为不同浓度样品+蒸馏水吸光度值;A0为蒸馏水+DPPH吸光度值[24-26].

3 结果与讨论

3.1 血红铆钉菇多糖的提取

3.1.1 单因素实验结果

(1)液料比对多糖得率的影响

液料比(mL·g-1)图2 液料比对血红铆钉菇多糖得率的影响

(2)微波功率对多糖得率的影响

由图3可知，在400 W至700 W范围内，多糖得率随功率增强而提高，但在超过700 W后，多糖产率开始下降.分析原因可能是由于大功率微波使物料温度升高，压力增大，破坏细胞结构，部分血红铆钉菇多糖发生水解且变性[28]，同时产生大量杂质，对水的渗入造成较大阻碍，导致血红铆钉菇多糖的得率下降.

微波功率/W图3 微波功率对血红铆钉菇多糖得率的影响

(3) 微波温度对多糖产率的影响

由图4可知，在70 ℃至100 ℃范围内，多糖得率随着温度的升高而增加.100 ℃之后，随温度升高，多糖得率开始下降，可能是由于温度继续升高使得多糖在高温下分解，从而导致多糖得率开始下降[29].

微波温度/℃图4 微波温度对血红铆钉菇多糖得率的影响

(4) 微波时间对多糖产率的影响

由图5可知，在5 min至10 min范围内，多糖得率随时间的增长而增长，且在10 min时达到最大产率，这是由于多糖溶出的过程是从固体溶质向液体溶剂转移的过程，在两者尚未达到平衡时，随时间增长其作用时间越长，最终达到平衡后，多糖得率达到最大；之后随时间增长多糖得率呈下降趋势.可能是由于微波时间过长，使得细胞内其他杂质溶出增加或者部分多糖结构产生变化，使得多糖得率降低[30].

微波时间/min图5 微波时间对血红铆钉菇多糖得率的影响

3.1.2 响应面试验结果分析

(1) 响应面分析方案与结果

在单因素试验结果的基础上，以血红铆钉菇多糖得率为目标值，选定4因素3水平进行响应面优化设计，结果见表2.

表2 响应面优化设计及试验结果表

对上表试验数据进行回归分析，得到关于A、B、C、D的拟合方程如下：

多糖产率=14.77+0.097A-0.22B+0.28C+0.20D-0.12AB-0.26AC+0.15AD+0.13BC+0.44BD+0.29CD-0.44 A2-0.43B2-0.49C2-0.61D2

对此回归模型系数进行显著性检验，结果见表3.

表3 回归模型方差分析表

由表3可以得出，多糖得率模型F值为33.66，P值小于0.000 1，此模型达到高度显著水平，失拟项为0.785 7，失拟不显著，表明实验与模型拟合程度比较好，实验误差比较小，该方程能够预测和解释血红铆钉菇多糖得率随微波萃取各因素变化的规律.

(2) 响应面57图形分析

根据回归方程分析结果做出相应的响应等高线图(见图6)和曲面图(见图7)，以确定微波温度、微波时间、微波功率和液料比这4个因素对多糖得率的影响，以此来推测出因变量.

图6 各交互因素对血红铆钉菇多糖得率影响的等高线图

图7 各交互作用对血红铆钉菇多糖得率影响的响应曲面图

响应面分析的图形是特定的响应值对应自变量构成的三维立体图形，可以直观反映出各因素对响应值的影响，从试验所得的响应面分析图上可找到它们在反应过程中的交互作用[31].

图7反映出了各因素交互作用对响应值，即多糖得率的影响.等高线的形状反映了交互效应的强弱，等高线若趋于圆形则表明两个因素交互作用不显著，趋于椭圆则相反[31].总体来看，除去功率和时间与功率和温度两组外，其他各组因素对多糖得率的影响都十分显著.

3.1.3 验证试验

根据以上试验结果验证其是否与真实情况一致或者相似.考虑到实际操作，将微波功率修正为600 W，按此条件进行验证试验，重复三次，以验证试验检测值与理论预测值的相符程度，实验结果见表4.

表4 验证性试验结果表

验证实验的平均产率为15.31%，通过方差分析表明，实际测试值与预测值差异不显著，说明该模型可以较为可靠地模拟和预测血红铆钉菇多糖的产率，从而也证明了采用响应面法优化血红铆钉菇多糖提取条件参数的可行性.

3.2 Sevage法去蛋白试验结果

用Sevage法去除蛋白8次后，每次测定其吸光度，其结果见图8.

去蛋白次数/次图8 Sevage法去蛋白折线图

由上图可以看出，去蛋白到第7次后，吸光度与第6次相比极为接近，为减小损耗、节约试剂，本试验以去除6次为最佳.其余蛋白质可能是通过化学键与多糖相连接，Sevage试剂无法将其除去.

3.3 血红铆钉菇多糖清除DPPH自由基能力的测定

研究发现，大多数的多糖具备将自由基清除或者提高抗氧化活性来延缓氧化[32].DPPH自由基是一种十分稳定的以氮为中心的自由基，在517 nm波长处其孤对电子有较强的吸收，当存在自由基清除剂时，孤对电子被配对，吸收消失或减弱[33].本试验在517 nm波长处测其吸光度，通过DPPH清除率计算公式来评价血红铆钉菇多糖对DPPH自由基的清除能力.如图9所示，血红铆钉菇多糖有显著的清除DPPH自由基的能力，且在一定范围内随质量浓度的升高其清除能力增强.6号样品的DPPH自由基清除率最高，即浓度为20 mg/mL时，其自由基清除率为77%.