张 超，张国珍，马 凯

(兰州交通大学 环境与市政工程学院，兰州 730070)

西北干旱地区村镇生活污水水质单一，经适当处理后可就近用于村镇周边农作物灌溉，从而有效解决当地水资源短缺和水环境污染问题[1-2].

ABR处理污水费用低、污泥产率低，但其启动时间长、出水COD较高，出水难以长期稳定地满足农作物灌溉水质标准[3-5].研究表明，在ABR中添加弹性填料可以缩短其启动时间[6]，提高其对COD去除效果的稳定性[7]，强化其抗低温和抗负荷能力[8-9]，且对氮磷去除率影响很小[10].但这些研究都是关于添加弹性填料对ABR去除COD的整体强化效果，而关于添加弹性填料对ABR各隔室中COD的去除效果及细菌群落结构的影响研究却未见报道.

目前通过高通量测序技术研究污染物去除与微生物群落结构组成及丰度变化的关系的报道较多[11-12]，且该技术在ABR中的研究也有所涉及.陈重军等[13]研究了厌氧氨氧化型ABR中的细菌群落结构，发现ABR中变形菌门丰度最高，且沿程增加，而浮霉菌门沿程降低.Shen等[14]研究了ABR-MBBR系统中的微生物群落结构，发现副球菌、硫杆菌和巴氏杆菌是系统中的优势菌.ABR中污染物的去除主要通过细菌的作用实现，故本文为研究添加弹性填料对ABR各隔室中COD的去除效果及细菌群落结构的影响，拟采用两组ABR进行对比，通过高通量测序技术研究添加弹性填料对ABR中细菌群落结构的影响，为有效解决西北干旱地区水资源短缺和水环境污染问题提供技术参考.

1 材料与方法

1.1 实验装置

两组ABR结构和尺寸完全一致，由四个隔室组成，长751 mm，宽180 mm，高500 mm，体积49.6 L.其中一组ABR的上部添加弹性填料，系统构造图如图1所示.

1.2 实验用水和方法

实验用水为校园家属区生活污水，COD浓度100.84～310.03 mg/L，氨氮浓度22.56～39.95 mg/L，总氮浓度24.91～45.37 mg/L，总磷浓度2.45～4.75 mg/L.两组ABR都在常温下运行，水力停留时间都为1 d，待两组ABR运行稳定后(已运行近10个月，对COD的去除效果已稳定1个月)，分别同时从两组ABR各隔室中取水样测定(每隔6 d取1次，共取5次).

1.3 分析项目与测定方法

COD：重铬酸钾法.

1.4 高通量测序分析方法

1.4.1 样本采集

待两组ABR运行稳定后，分别同时从两组ABR各隔室中取少量污泥，并从有弹性填料ABR中取弹性填料上少量的泥膜于10 mL离心管中.有弹性填料ABR第1～4隔室中的样本(污泥和泥膜的混合物)分别命名为A(A1、A2和A3)、B(B1、B2和B3)、C(C1、C2和C3)、D(D1、D2和D3)，无弹性填料ABR第1～4隔室中的样本(污泥)分别命名为E(E1、E2和E3)、F(F1、F2和F3)、G(G1、G2和G3)和H(H1、H2和H3)，所有样本先经-4 ℃冰箱冷冻，再包裹保温材料寄往检测公司.

1.4.2 DNA提取与检测

用Water DNA Isolation Kit试剂盒进行提取.

1.4.3 PCR扩增

用通用引物对细菌16S rRNA基因进行扩增，引物名称和序列为：上游(338F和ACTCCTACGGGAGGCAGCA)，下游(806R和GGACTACHVGGGTWTCTAAT).

1.4.4 PCR产物定量、混样

用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit进行定量，按样本所需的数据量进行混样.

1.4.5 文库构建

用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit进行建库.

1.4.6 文库质检与定量

取1 uL文库，用Agilent High Sensitivity DNA Kit做2100质检，用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit进行定量.

1.4.7 测序

测序区域为标准细菌16S V3-V4区，目的片段长度为480 bp，测序策略为NovaSeq-PE250.

1.5 数据分析、处理和统计方法

每个水样的COD测两组平行样，用Origin软件作图.每个泥样测三组平行样，OUT数目和各分类水平上的细菌群落结构丰度先取平均值，再用QIIME2软件作图，Alpha多样性指数直接作图.

通过细菌群落花瓣图分析，了解不同样本之间共有与特有物种数目的差异.通过Alpha多样性指数分析，了解某一样本中细菌群落的丰富度、多样性和均匀度.通过门(属)分类水平上的细菌群落结构分析，了解不同样本之间细菌群落结构在种类和相对丰度上的差异.

2 结果与讨论

2.1 COD的去除效果

两组ABR各隔室中平均COD去除率如图2所示.由图2可以看出，两组ABR第1隔室中的平均COD去除率最高，这主要是因为流入第1隔室中的污水COD最高，故第1隔室中的厌氧微生物可以优先利用进水中易于降解的COD.

与无弹性填料ABR相比，有弹性填料ABR第1隔室中的平均COD去除率较高，这主要是因为弹性填料可以较好地截留污水中的SS，且弹性填料上附着生长了一定量的微生物，使有弹性填料ABR第1隔室中的生物量有所增加.但有弹性填料ABR第2、3隔室中的平均COD去除率却低于无弹性填料ABR，这主要是因为进入无弹性填料ABR第2、3隔室中污水的COD较高.两组ABR第4隔室中的平均COD去除率相差不大，这主要是因为进入两组ABR第4隔室中污水的COD都很低.

图2 两组ABR各隔室中平均COD去除率Fig.2 The average removal rate of COD in each compartment of ABR in two groups

2.2 细菌群落花瓣图分析

两组ABR各隔室中细菌群落花瓣图如图3所示.由图3可以看出，两组ABR都是第1隔室中特有的OTU数目最多，且无弹性填料ABR各隔室中特有的OTU数目沿着水流方向逐渐减少，而有弹性填料ABR各隔室中特有的OTU数目虽然沿着水流方向上下波动，但总的趋势是减少的，表明两组ABR都是第1隔室中特有的细菌群落最多，且无弹性填料ABR各隔室中特有的细菌群落沿着水流方向逐渐减少，而有弹性填料ABR各隔室中特有的细菌群落虽然沿着水流方向上下波动，但总的趋势是减少的.这说明两组ABR前面隔室中较高的有机物浓度有利于特有细菌群落的生长和繁殖，而两组ABR后面隔室中较低的有机物浓度不利于特有细菌群落的生长和繁殖.

与无弹性填料ABR相比，有弹性填料ABR前三个隔室中特有的OTU数目较少，而最后一个隔室中特有的OTU数目较多，这说明弹性填料减少了ABR前三个隔室中特有的细菌群落，但增加了ABR最后一个隔室中特有的细菌群落.这主要是因为添加弹性填料使有弹性填料ABR各隔室中的生物量有所增加，而两组ABR进水中的有机物浓度相同，与无弹性填料ABR相比，有弹性填料ABR前三个隔室中特有的细菌群落所能获得的有机物较少，而取样期间有弹性填料ABR最后一个隔室中的有机物浓度可能高于无弹性填料ABR.

图3 细菌群落花瓣图Fig.3 Petal diagram of bacterial community

2.3 Alpha多样性指数

Chao1和Observed species指数用于衡量群落的丰富度，Simpson和Shannon指数用于衡量群落的多样性，Pielou’s evenness指数用于衡量群落的均匀度[15].两组ABR各隔室中细菌群落丰富度和均匀度变化如表1所列.由表1可以看出，两组ABR各隔室中Chao1指数和Observed species指数、Simpson指数和Shannon指数总的趋势是沿着水流方向逐渐减小，这说明两组ABR各隔室中细菌群落的丰富度和多样性总的趋势是沿着水流方向逐渐降低，这主要是因为两组ABR各隔室中有机物浓度总的趋势是沿着水流方向逐渐降低.与无弹性填料ABR相比，有弹性填料ABR前三个隔室中Chao1指数和Observed species指数、Simpson指数和Shannon指数有所降低，而最后一个隔室中Chao1指数和Observed species指数、Simpson指数和Shannon指数有所提高，这说明弹性填料降低了ABR前三个隔室中细菌群落的丰富度和多样性，但提高了ABR最后一个隔室中细菌群落的丰富度和多样性.这主要是因为添加弹性填料使有弹性填料ABR各隔室中的生物量有所增加，而两组ABR进水中的有机物浓度相同，与无弹性填料ABR相比，有弹性填料ABR前三个隔室中细菌群落所能获得的有机物较少，而取样期间有弹性填料ABR最后一个隔室中的有机物浓度可能高于无弹性填料ABR.两组ABR各隔室中Pielou’s evenness指数总的趋势是沿着水流方向逐渐减小，这说明两组ABR各隔室中细菌群落的均匀度总的趋势是沿着水流方向逐渐降低.与无弹性填料ABR相比，有弹性填料ABR第1、3隔室中Pielou’s evenness指数有所降低，而第2、4隔室中Pielou’s evenness指数有所提高，这说明弹性填料降低了ABR第1、3隔室中细菌群落的均匀度，但提高了ABR第2、4隔室中细菌群落的均匀度.

表1 细菌群落丰富度、多样性和均匀度变化

2.4 门分类水平上的细菌群落结构

门分类水平上的细菌群落结构图体现了样本在门分类水平上细菌群落的种类和相对丰度.两组ABR各隔室中门分类水平上的细菌群落结构如表2所列.由表2可以看出，两组ABR各隔室中门分类水平上的优势细菌群落(相对丰度达到1%)包括：Actinobacteria(放线菌门)、Firmicutes(厚壁菌门)、Bacteroidetes(拟杆菌门)、Chloroflexi(绿弯菌门)、Proteobacteria(变形菌门)和Synergistetes(互养菌门)，这些优势细菌群落的平均相对丰度之和超过80%.有研究表明，变形菌门的存在有利于硝化反硝化作用、生物除磷和污染物的降解[16]，厚壁菌门的存在有利于硝化作用和有机物的降解[17]，拟杆菌门的存在有利于反硝化作用、蛋白质和有机物的降解[18]，放线菌门的存在有利于氨基酸等有机物的降解[19]，绿弯菌门的存在有利于溶解性有机物、EPS和微生物残体的降解[20]，互养菌门的存在有利于产甲烷阶段的进行[21].

表2 门分类水平上的细菌群落结构

表2中，Synergistetes在两组ABR各隔室中的平均相对丰度最高，且两组ABR各隔室中Synergistetes的相对丰度沿着水流方向逐渐提高，这说明Synergistetes是两组ABR各隔室中最具优势的细菌群落，且沿着水流方向逐渐增殖.虽然两组ABR各隔室中Actinobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes、Chloroflexi和Proteobacteria的相对丰度沿着水流方向有所波动，但从总的趋势来看，两组ABR各隔室中Firmicutes、Chloroflexi和Proteobacteria的相对丰度沿着水流方向降低，Actinobacteria的相对丰度沿着水流方向提高；而Chloroflexi在无弹性填料ABR各隔室中的相对丰度沿着水流方向降低，在有弹性填料ABR各隔室中的相对丰度沿着水流方向提高，这说明两组ABR各隔室中Actinobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes、Chloroflexi和Proteobacteria沿着水流方向经历了增殖和衰减的交替变化，最终，Firmicutes、Chloroflexi和Proteobacteria出现了衰减，Actinobacteria出现了增殖，而Chloroflexi在无弹性填料ABR中出现了衰减，在有弹性填料ABR中出现了增殖.

与无弹性填料ABR相比，有弹性填料ABR第1隔室中Synergistetes的相对丰度提高较多，Chloroflexi的相对丰度降低较多；第2隔室中Proteobacteria的相对丰度提高较多，Bacteroidetes的相对丰度降低较多；第3隔室中Chloroflexi和Synergistetes的相对丰度提高较多，Firmicutes和Bacteroidetes的相对丰度降低较多；第4隔室中Proteobacteria和Firmicutes的相对丰度提高较多，Synergistetes的相对丰度降低较多.这说明添加弹性填料使ABR第1隔室中Synergistetes增殖较多，Chloroflexi衰减较多；第2隔室中Proteobacteria增殖较多，Bacteroidetes衰减较多；第3隔室中Chloroflexi和Synergistetes增殖较多，Firmicutes和Bacteroidetes衰减较多；第4隔室中Proteobacteria和Firmicutes增殖较多，Synergistetes衰减较多.

2.5 属分类水平上的细菌群落结构

属分类水平上的细菌群落结构图体现了样本在属分类水平上细菌群落的种类和相对丰度.两组ABR各隔室中属分类水平上的细菌群落结构如表3所列.由表3可以看出，两组ABR各隔室中属分类水平上的优势细菌群落包括：Desulfobulbus(脱硫叶菌属)、Aminiphilus、Syntrophorhabdus(互营杆菌属)、Smithella(史密斯氏菌属)、ChristensenellaceaeR-7group、JGI-0000079-D21、Lactivibrio和Desulfomicrobium(脱硫微菌属)，这些优势细菌群落的平均相对丰度之和接近15%.

表3中，Desulfomicrobium在两组ABR各隔室中的平均相对丰度最高，且两组ABR各隔室中Desulfomicrobium的相对丰度沿着水流方向逐渐降低，这说明Desulfomicrobium是两组ABR各隔室中最具优势的细菌群落，且沿着水流方向逐渐衰减.虽然两组ABR各隔室中Desulfobulbus、Aminiphilus、Syntrophorhabdus、Smithella、ChristensenellaceaeR-7group、JGI-0000079-D21和Lactivibrio的相对丰度沿着水流方向有所波动，但从总的趋势来看，两组ABR各隔室中Desulfobulbus和Syntrophorhabdus的相对丰度沿着水流方向降低，Aminiphilus的相对丰度沿着水流方向提高；在无弹性填料ABR各隔室中，JGI-0000079-D21的相对丰度沿着水流方向提高，Smithella、ChristensenellaceaeR-7group和Lactivibrio的相对丰度沿着水流方向降低，而在有弹性填料ABR各隔室中，Smithella、ChristensenellaceaeR-7group、JGI-0000079-D21和Lactivibrio的相对丰度沿着水流方向变化很小，这说明两组ABR各隔室中Desulfobulbus、Aminiphilus、Syntrophorhabdus、Smithella、ChristensenellaceaeR-7group、JGI-0000079-D21和Lactivibrio沿着水流方向经历了增殖和衰减的交替变化，最终，Desulfobulbus和Syntrophorhabdus出现了衰减，Aminiphilus出现了增殖；而在无弹性填料ABR各隔室中，JGI-0000079-D21出现了增殖，Smithella、ChristensenellaceaeR-7group和Lactivibrio出现了衰减，在有弹性填料ABR各隔室中，Smithella、ChristensenellaceaeR-7group、JGI-0000079-D21和Lactivibrio增殖和衰减不明显.

表3 属分类水平上的细菌群落结构

与无弹性填料ABR相比，有弹性填料ABR第1隔室中Smithella和JGI-0000079-D21的相对丰度提高较多，Desulfomicrobium的相对丰度降低较多；第2隔室中Desulfobulbus和Desulfomicrobium的相对丰度提高较多；第3隔室中Smithella和Desulfomicrobium的相对丰度降低较多；第4隔室中Smithella、ChristensenellaceaeR-7group和Desulfomicrobium的相对丰度提高较多，Aminiphilus、JGI-0000079-D21和Lactivibrio的相对丰度降低较多.这说明添加弹性填料使ABR第1隔室中Smithella和JGI-0000079-D21增殖较多，Desulfomicrobium衰减较多；第2隔室中Desulfobulbus和Desulfomicrobium增殖较多；第3隔室中Smithella和Desulfomicrobium衰减较多；第4隔室中Smithella、ChristensenellaceaeR-7group和Desulfomicrobium增殖较多，Aminiphilus、JGI-0000079-D21和Lactivibrio衰减较多.

3 结论

1) 弹性填料提高了ABR第1隔室中的平均COD去除率，降低了第2、3隔室中的平均COD去除率，对第4隔室中的平均COD去除率影响不大.

2) 弹性填料减少了ABR第1～3隔室中特有的细菌群落，但增加了ABR第4隔室中特有的细菌群落.

3) 弹性填料降低了ABR第1～3隔室中细菌群落的丰富度和多样性，第1、3隔室中细菌群落的均匀度；但提高了ABR第4隔室中细菌群落的丰富度和多样性，第2、4隔室中细菌群落的均匀度.

4) 在门分类水平上，添加弹性填料使ABR第1隔室中Synergistetes增殖较多，Chloroflexi衰减较多；第2隔室中Proteobacteria增殖较多，Bacteroidetes衰减较多；第3隔室中Chloroflexi和Synergistetes增殖较多，Firmicutes和Bacteroidetes衰减较多；第4隔室中Proteobacteria和Firmicutes增殖较多，Synergistetes衰减较多.

5) 在属分类水平上，添加弹性填料使ABR第1隔室中Smithella和JGI-0000079-D21增殖较多，Desulfomicrobium衰减较多；第2隔室中Desulfobulbus和Desulfomicrobium增殖较多；第3隔室中Smithella和Desulfomicrobium衰减较多；第4隔室中Smithella、ChristensenellaceaeR-7group和Desulfomicrobium增殖较多，Aminiphilus、JGI-0000079-D21和Lactivibrio衰减较多.