陈启航 方旭波 陈小娥 池海波 余 辉 田 方 王坚强

(1浙江海洋大学食品与药学学院，浙江 舟山 316022； 2 浙江国际海运职业技术学院， 浙江 舟山 316021；3 浙江融创食品工业有限公司，浙江 舟山 316000)

鲣鱼(Katsuwonus pelamis)俗称炸弹鱼，是一种具有较高经济效益的金枪鱼，其产量约占世界主要金枪鱼总产量的48%，低脂肪且富含蛋白质[1-3]。在日本，以鲣鱼食材为原料的调味品深受广大消费者的青睐[4]。在我国，鲣鱼鱼柳和罐头加工行业刚起步，其加工副产物鲣鱼蒸煮液，营养丰富，富含水溶性蛋白质、多肽等成分，但尚未得到有效利用，主要是由于其腥味较重，消费者不易接受。美拉德反应指食品体系中含氨基化合物与含羰基化合物之间发生的非酶促反应，能使食品产生愉快的香味和诱人的色泽[5-6]。在食品生产中将酶解技术和脱腥工艺相结合，并利用美拉德反应赋予产品独特的香味和良好的色泽，既能解决鲣鱼蒸煮液腥味重的问题，也能为后续开发新型的鲣鱼调味料提供研究基础。

目前，调味料的风味优劣大多直接通过感官评价进行判定，易受测评人员的个人喜好影响，存在一定的主观性和局限性[7]。电子鼻技术是通过传感器阵列的响应曲线来分析样品的挥发性气味，不仅可以识别各种不同的气味，而且可对被测样品中的成分进行定性分析，测定结果比感官评价更客观，已在食品风味表征中得到广泛应用[8-9]。周明珠等[10]利用电子鼻对不同保压时间条件下的鲈鱼气味进行区分，发现不同保压时间对鲈鱼气味影响不显著；蒙万隆等[11]应用电子鼻技术检测猪肉的挥发性气味，能够预测不同肥瘦配比猪肉的新鲜度；苗钰湘等[12]利用电子鼻技术检测不同贮藏时间下三疣梭子蟹肉的气味变化，从而建立了测定三疣梭子蟹鲜度的方法。而利用电子鼻评价鲣鱼蒸煮液在美拉德反应条件下产生的风味变化鲜有报道。

本试验以经木瓜蛋白酶水解后的鲣鱼酶解液为原料，利用美拉德反应对酶解液进行呈色和增香，以感官评价和褐变程度为指标，考察不同木糖和葡萄糖配比、加热时间、温度和pH 值对美拉德反应的影响，同时采用电子鼻技术结合主成分分析(principal component analysis，PCA)和线性判别分析(linear discriminant analysis， LDA)优化美拉德反应条件[13-14]，并对优化条件下的反应产物进行氨基酸组成成分分析和必需氨基酸营养评价，以期为鲣鱼蒸煮液的高值化应用提供一定的思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

-20℃贮存的鲣鱼蒸煮液，蛋白质含量为3．71%，浙江融创食品工业有限公司；木瓜蛋白酶(1 ×105U.g-1)，南宁庞博生物工程有限公司；安琪高活性干酵母，安琪酵母股份有限公司；D-木糖、D-葡萄糖，安徽酷尔生物工程有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

HHS 型电热恒温水浴锅，上海棱光技术有限公司；TGL-16C 低速大容量离心机，军事医学科学院实验仪器厂；PEN3 型便携式电子鼻，德国Airsense 公司；UV-5900 紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；YXQ-LS-50G 压力蒸汽灭菌器，上海科晓科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1．3．1 工艺流程 鲣鱼蒸煮液→酶解→灭酶→离心→酵母脱腥→美拉德反应→浓缩→成品。

1．3．2 工艺要点 参照文献[3]制备鲣鱼酶解液，酵母发酵脱腥处理条件：0．75%的酵母添加量、在35℃条件下发酵60 min。

1．3．3 鲣鱼酶解液美拉德反应单因素试验 以添加还原糖1．0 g(木糖-葡萄糖配比分别为1 ∶3、1 ∶2、1 ∶1、2 ∶1、3 ∶1， m ∶m)、温度(100、105、110、115、120℃)、反应时间(30、40、50、60、70 min)、pH 值(5、6、7、8、9)作为单因素，研究不同因素对鲣鱼酶解液美拉德反应产物的影响，其余各因素设定温度110℃、加热时间40 min、还原糖配比2 ∶1(m ∶m)、pH 值7．0，每组各做3次平行，以此确定美拉德反应的最优工艺条件，并对鲣鱼酶解液美拉德产物进行电子鼻分析[7]。

1．3．4 鲣鱼酶解液美拉德反应条件优化 在单因素试验的基础上，选取对鲣鱼酶解液美拉德反应影响较大的3个单因素，进行正交试验。正交试验设计及水平见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1．3．5 感官评定 选择10 名食品专业的学生，针对鲣鱼酶解液美拉德反应产物，以滋味、色泽、气味、形态四项指标作为评价标准，对其进行感官评定，总分40 分，其中气味、形态、滋味、色泽各10 分，分值越大，说明产物产生的风味越好，结果是剔除异常数再取平均值，评分标准如表2 所示。

表2 美拉德反应产物感官评价表Table 2 The sensory evaluation table of Maillard reaction products

1．3．6 褐变程度测定 按文献[15]的方法，将鲣鱼酶解液稀释25 倍后，于420 nm 波长处测定其产物的吸光度值，吸光度值即表示褐变程度。

1．3．7 电子鼻分析 将20 mL 鲣鱼酶解液美拉德反应产物置于离心管中，密封，室温下静置40 min，进行电子鼻检测分析[16]，每组做3 个平行。通过电子鼻的WinMuster 软件，对采集到的样品气味信息进行PCA 和LDA[17]。

1．3．8 氨基酸营养评价 对美拉德反应优化后的产物进行氨基酸营养评价，参照王念民等[18]的方法计算氨基酸评分(amino acid score，AAS)和必需氨基酸指数(essential amino acid index，EAAI)，参照雷锦桂等[19]的方法计算氨基酸比值系数(ratio coefficient，RC)。氨基酸的测定： 色氨酸采用可见分光光度计法进行测定[20]，其余17 种氨基酸利用氨基酸自动分析仪分析[21]。

1.4 数据分析

所有试验重复3 次。采用Origin Pro 8．5 软件绘图，SPSS 18．0 软件进行正交试验分析。

2 结果与分析

2.1 鲣鱼酶解液美拉德工艺优化单因素试验

2．1．1 木糖-葡萄糖配比对鲣鱼酶解液美拉德反应的影响 还原糖是参与美拉德反应的重要物质，不同的还原糖种类会使美拉德反应产生不同的风味，其中核糖、木糖、葡萄糖与氨基酸发生美拉德反应产生的风味良好，但核糖的价格相对较贵，而木糖、葡萄糖廉价可行，操作简单[22]，所以本试验选择葡萄糖和木糖。由图1-A 和1-B 可知，当木糖-葡萄糖配比为1 ∶2时，鲣鱼酶解液美拉德反应产物的褐变程度最大，吸光度在420 nm 处达到最大值(0．676)，同时，感官评分也达到最高值(33．5 分)。由图1-C 可知，第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)贡献率分别为98．54%和0．93%，主成分贡献率之和为99．47%，说明主成分可以代表不同木糖-葡萄糖配比鲣鱼酶解液美拉德反应产物挥发性气味的主要特征信息。木糖-葡萄糖配比为1 ∶1、1 ∶2和2 ∶1条件下的椭圆位置接近，区分效果不明显，需要进行进一步区分。由图1-D 可知，PC1 和PC2 的贡献率分别为98．80%和1．03%，两者累计贡献率为99．83%。椭圆位置互不重叠，区分程度明显，说明LDA 能够很好地区分不同木糖-葡萄糖配比条件下鲣鱼酶解液美拉德反应产物的挥发性风味，区分度优于PCA。此外，LDA 中，当木糖-葡萄糖配比为1 ∶2时，椭圆与其他椭圆位置最远，说明该条件下鲣鱼酶解液美拉德反应产物品质较优。综上所述，选择木糖-葡萄糖配比为1 ∶2进行正交优化试验。

图1 还原糖配比对鲣鱼酶解液美拉德反应的影响分析Fig.1 Effect of reducing sugar ratio on Maillard reaction of Skipjack tuna enzymatic hydrolyzate

2．1．2 温度对鲣鱼酶解液美拉德反应的影响 由图2-A 和2-B 可知，温度低于11℃时鲣鱼酶解液美拉德反应随着温度的不断升高，褐变程度也随之增加，香味物质不断积累，感官评分也随之增加；110℃后，温度变化对褐变程度影响较小，且感官评分随着温度的升高而略有降低。由图2-C 可知，PC1 和PC2 贡献率分别为97．85%和1．43%。其中，105℃和115℃之间相距较近，区分效果不太明显，需进一步区分。由图2-D 可知，PC1 贡献率为66．07%，PC2 的贡献率为33．39%，两者贡献率之和为99．46%，且椭圆位置互不重叠，说明不同温度条件下的美拉德反应产物的风味通过LDA 能够进行较好地区分。通过图2-D 横纵坐标，结合图2-A 和2-B 可知，100℃和120℃的椭圆位置与110、115 和105℃的椭圆位置有较大间距，可能是由于温度过高或过低的影响。综上所述，选择温度为110℃进行正交优化试验。这与刘安军等[23]的研究结果相似。

图2 温度对鲣鱼酶解液美拉德反应的影响分析Fig.2 Effect of temperature on Maillard reaction of Skipjack tuna enzymatic hydrolyzate

2．1．3 反应时间对鲣鱼酶解液美拉德反应的影响 如图3-A、B 所示，反应前期，随着鲣鱼酶解液美拉德反应时间的延长，褐变程度逐渐增加，香味物质也随之产生。感官评分也随着反应的进行随之增加；反应过程中，由于葡萄糖和木糖不断被消耗，褐变程度增加逐渐减缓；当反应时间超过40 min 后，美拉德产物会产生一定的焦糊味和其他异味，因此感官评分也逐渐降低。由图3-C 可知，PC1 和PC2 贡献率分别为91．67%和5．40%。50 和60 min 的椭圆位置存在部分重叠，表明有相似挥发性成分，区分程度不太明显。由图3-D 可知，PC1 和PC2 的贡献率分别为95．03%和3．48%，两者累计贡献率为98．51%，且有各自的区域范围，无重叠交叉，区分程度高。通过图3-D 横纵坐标比较，结合图3-B 可知，当时间达到40 min 后，随着时间的延长，感官评分逐渐降低。因此，选择反应时间为40 min 进行正交优化试验。这与王玉芬等[24]的研究结果相似。

2．1．4 pH 值对鲣鱼酶解液美拉德反应的影响 由图4-A、B 可知，pH 值增大会加快鲣鱼酶解液美拉德反应进程，当pH 值为7 时，在420 nm 波长处的吸光度值为0．696，达到最大值，感官评分为31．6 分。由图4-C可知，PC1 和PC2 贡献率分别为77．73%和16．79%，总贡献率为94．52%。pH 值7．0 和8．0 处的椭圆位置存在交叉，说明存在相似的挥发性成分，需进一步区分。由图4-D 可知，PC1 和PC2 的贡献率分别为89．20%和9．17%，两者累计贡献率为98．37%，且椭圆位置互不重叠，说明能够对不同pH 值条件下的鲣鱼酶解液美拉德产物风味进行良好区分。结合图4-A、B可得，pH 值过高或过低，都会影响香气成分。因此，选择pH 值为7。

图3 反应时间对鲣鱼酶解液美拉德反应的影响Fig.3 Effect of reaction time on Maillard reaction of Skipjack tuna enzymatic hydrolyzate

2.2 鲣鱼酶解液美拉德工艺优化正交试验

根据单因素试验结果可知，木糖-葡萄糖配比(A)、温度(B)以及反应时间(C)对鲣鱼酶解液美拉德反应影响较大。由表3 可知，就褐变程度而言，各因素对鲣鱼酶解液美拉德反应影响的大小顺序为A＞B＞C；由感官评分可知，各因素对美拉德反应影响大小的顺序为A＞C＞B。综合木糖-葡萄糖配比、温度、反应时间3 个因素对美拉德反应产物的影响，得出美拉德工艺最佳条件为A2B2C3，即木糖-葡萄糖配比为1 ∶2，温度110℃，时间45 min，在此基础上进行了验证试验，试验平行3 次，结果表明，褐变程度A420分别为0．631、0．626、0．634，平均值为0．630，感官评分分别为34．7、35．0、35．1 分，平均值为34．9 分，其中感官评分高于表3 中的任一数据，说明正交试验得到的美拉德工艺优化参数具有适用性和可靠性。所得产物鱼香味浓郁、口感细腻，色泽为黄棕色。

2.3 游离氨基酸组成成分分析及相关营养评价

由表4 可知，鲣鱼酶解液美拉德产物中存在18 种氨基酸，氨基酸种类齐全，与鲣鱼酶解液相比，其氨基酸含量减少较明显的主要有苯丙氨酸(36．76%，减少百分比，下同)、组氨酸(31．07%)、半胱氨酸(25．72%)、丝氨酸(15．93%)，说明这几种氨基酸是参与该美拉德反应产香味的主要氨基酸。另外，美拉德产物中呈味氨基酸丰富，其中甘氨酸含量较多。

由表5 可知，当以AAS 为标准时，鲣鱼酶解液美拉德产物中色氨酸评分最高，其次为蛋氨酸+半胱氨酸；以RC 为标准时，氨基酸最小值为第一限制性氨基酸[25]，鲣鱼酶解液美拉德产物的亮氨酸的RC 值最小，因此亮氨酸为第一限制性氨基酸。EAAI 是一项营养指标，常用来评价蛋白质营养价值[26]，鲣鱼酶解液美拉德产物的EAAI 为64．034，表明其营养价值丰富，是理想的调味基料，值得进一步研究开发利用。

3 讨论

图4 pH 值对鲣鱼酶解液美拉德反应的影响Fig.4 Effect of pH value on Maillard Reaction of Skipjack tuna enzymatic hydrolyzate

表3 鲣鱼酶解液美拉德工艺优化正交试验结果Table 3 Orthogonal experiment results of Maillard reaction optimization for Skipjack tuna enzymatic hydrolyzate

表4 氨基酸组成分析Table 4 Analysis of amino acid composition /(g·100g-1)

表5 鲣鱼酶解液美拉德反应产物必需氨基酸营养评价Table 5 Nutritional evaluation of essential amino acids in Maillard reaction products of Skipjack tuna enzymatic hydrolyzate

美拉德反应是指羰基化合物的羰基和氨基化合物的氨基之间发生的复杂反应，因其反应产物能对食品的风味产生至关重要的影响，已广泛应用于海鲜调味料的制备。李学鹏等[27]通过美拉德反应改善四角蛤蜊酶解液风味，所得产物具有浓郁的鲜香味。郭福军等[28]研究了美拉德反应对河蚌酶解液风味的影响，结果表明，美拉德反应使河蚌肉酶解液肉香味浓郁。由于鲣鱼蒸煮液本身腥味很重，加上酶解过程中脂质的氧化降解以及蛋白质降解，使得鲣鱼酶解液的腥味也较重，影响食用。本研究结果表明，木糖-葡萄糖配比、温度、反应时间3 个因素对美拉德反应影响较大，通过优化美拉德反应，可将鲣鱼蒸煮液制成鲜味佳且含有丰富游离氨基酸的海鲜调味料。

采用PCA 和LDA 方法分析电子鼻数据能够区分样品间的差异性，已经逐步应用于食品工业等领域。李迎楠等[29]采用电子鼻技术结合PCA 和LDA 检测不同反应温度对牛肉风味品质的影响，结果表明，不同温度条件下肉味香精差异显著。冯敏等[30]采用电子鼻技术结合PCA 和LDA 检测辐照肉鸭产品中挥发性风味物质的变化，结果表明，经辐照处理后样品的挥发性风味物质的响应值均发生了变化。本研究在感官评价的基础上，采用电子鼻技术结合LDA 能够更有效地区分样品间的差异性，并得出最优美拉德反应条件。后续研究将结合气质色谱联用仪(gas chromatographymass spectrometer， GC-MS)对其挥发性物质进行深入研究。

美拉德反应较为复杂，研究人员大多对此类美拉德反应前后产物氨基酸成分进行研究，获得少量特定的氨基酸与糖进行美拉德反应的产物的特征。氨基酸(尤其是游离氨基酸)对海鲜调味基料的呈味起着重要的作用。张慧芳等[31]在对鱿鱼内脏水解液美拉德反应前后氨基酸分析时发现，鱿鱼内脏水解液美拉德反应后产物组氨酸、脯氨酸、精氨酸、苯丙氨酸4 种氨基酸减少比例较明显，是参与美拉德反应的主要氨基酸。童彦等[32]分析鳙鱼蛋白水解液美拉德反应前后氨基酸时发现，蛋白水解液美拉德产物中精氨酸、赖氨酸和酪氨酸减少较明显，是参与美拉德反应的主要氨基酸。本研究发现，鲣鱼酶解液经美拉德反应后，其氨基酸含量有一定程度的下降，苯丙氨酸、组氨酸、半胱氨酸和丝氨酸相对于其他氨基酸减少较明显，说明这4 种氨基酸可能是参与该美拉德反应的主要氨基酸。其中反应产物的必需氨基酸总含量较高，具有良好的营养性。另外，鲣鱼酶解液美拉德产物的氨基酸组成丰富，共检测出18 种氨基酸。其中，谷氨酸、甘氨酸和天冬氨酸相对含量较高，谷氨酸和天冬氨酸为鲜味氨基酸，甘氨酸为甜味氨基酸，能使海鲜调味料香气浓郁，这对利用鲣鱼酶解液进行美拉德反应制备海鲜调味料有重要的意义。

4 结论

本研究通过单因素试验对鲣鱼酶解液美拉德反应影响因素进行研究，结果表明，木糖-葡萄糖配比、温度及反应时间对鲣鱼酶解液美拉德反应影响较大。在单因素试验的基础上，结合正交试验得到鲣鱼酶解液的最佳美拉德条件为木糖-葡萄糖配比1 ∶2、温度110℃、反应时间45 min，此时美拉德反应产物的吸光度值为0．630，感官评分为34．9 分。氨基酸组成成分分析发现，美拉德产物中共检出18 种氨基酸，呈味氨基酸含量丰富。本研究为鲣鱼酶解液的高值化利用提供了一种新的思路，对开发鲣鱼风味食品具有指导意义。