张帆 王禹淳 姜坤生 李思瑶 宋佰芬

摘 要：牛疱疹病毒Ⅰ型（BoHV-1）可以引起多种临床疾病，如牛传染性鼻气管炎（IBR）、传染性脓疱性外阴阴道炎（IPV）以及结膜炎等，是牛的一种急性、热性、接触性传染病，对乳牛产奶量、公牛繁殖力及役用牛的使役力均有较大影响，每年造成极大的经济损失。牛疱疹病毒Ⅰ型的早期准确诊断和治疗对于该病的防控具有重要作用。目前，牛疱疹病毒Ⅰ型的检测方法主要有临床诊断、病原学诊断和血清学诊断等，各有优缺点。该文总结概述了牛疱疹病毒Ⅰ型的各种常用诊断方法，旨在为该病的进一步研究和诊断防控提供参考。

关键词：BoHV-1;临床诊断;病原学诊断;分子生物学诊断;血清学诊断

中图分类号 S852.65+9.1文献标识码 A文章编号 1007-7731（2021）02-0093-05

Overview of Bovine Herpesvirus Type I Detection Technology

ZHANG Fan et al.

（College of Life Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing163319，China ）

Abstract： Bovine Herpesvirus Type I （BoHV-1） can cause a variety of clinical diseases，such as bovine infectious rhinotracheitis （IBR），infectious pustular vulvovaginitis （IPV） and conjunctivitis. It is an acute，heat and contact infectious disease of cattle. It has a great impact on the milk yield of dairy cows，the fertility of bulls and the enabling power of cattle. It causes great economic losses. The early accurate diagnosis and treatment of bovine herpesvirus type I plays an important role in the prevention and control of the disease. At present，the detection methods of bovine herpesvirus type I mainly include clinical diagnosis，pathogenic diagnosis，and serological diagnosis，and each has its own advantages and disadvantages. This articlesummarizes the various commonly used diagnostic methods for bovine herpesvirus type I，aiming to provide reference for further research and diagnosis and prevention of the disease.

Key words： BoHV-1;Clinical diagnosis;Pathogenic diagnosis;Molecular biological diagnosis;Serological diagnosis

牛皰疹病毒Ⅰ型（bovine herpesvirus type-1，BoHV-1）是一种粒子直径为150～200nm、具有脂质囊膜的DNA球状病毒，该病毒具有162个壳粒的20面体核衣壳[1]。BoHV-1的基因组全长为13.3Kb，可编码80多个蛋白质。除非结构蛋白外，BoHV-1还包含gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gK、gL、gM等发挥主要功能的结构蛋白，其中编码基因位于BoHV-1长独特区的有gB、gC、gH、gK、gL、gM等糖蛋白，编码基因位于BoHV-1短独特区的有gD、gE、gG、gI等糖蛋白。这些结构糖蛋白的主要功能是在病毒感染过程中配合完成病毒的吸附、渗透、复制和组装等过程。例如，gB、gC、gD糖蛋白是刺激宿主产生免疫应答反应的最主要的几种抗原蛋白[2-4]。

BoHV-1在养牛业可引起多种传染性临床疾病，在我国多个省市地区广泛流行，对奶牛产奶量、肉牛繁殖力及生产率均有极大影响，在全球范围内造成重大经济损失。1956年Madin等[5]首次从患病牛体内成功分离出BoHV-1，1964年Huck[6]对BoHV-1进行鉴定并成功确认该病毒属于疱疹病毒科α-疱疹病毒亚科。20世纪80年代，欧洲西部多个国家地区暴发了极其严重的牛传染性鼻气管炎[7]。与此同时，国内周泰冲等[8]在进口种牛中发现了BoHV-1并对其进行了分离鉴定。近年来，国内BoHV-1的血清学调查结果显示：河南、四川、贵州、广东、广西、山东、新疆等地区的黄牛、水牛和中国荷斯坦奶牛中均出现BoHV-1感染现象[9]。

BoHV-1侵入宿主体内细胞后，通过微管途径利用其自身含有的多种功能性蛋白的吸附、入侵和运输功能将病毒运输至细胞核内，并利用宿主细胞本身所具有的各种物质完成复制过程，离开核膜后，BoHV-1先完成外部囊膜的包被，然后通过囊泡的运输作用排除到细胞外，完成释放过程[10]。BoHV-1最大特点是组织侵染力强，可以感染多个组织，包括呼吸系统、生殖系统、神经系统、多处粘膜和胎儿[11]。BoHV-1初次感染宿主后，病毒粒子可以沿感觉神经进行迁移，最终以DNA的形式继续存在于神经系统的神经原细胞内。当病毒接受刺激性药物的治疗，或者气候、饲养条件的改变以及较为恶劣的运输条件，都可以使潜伏状态的的病毒重新激活，在潜伏感染动物的上皮细胞内进行大量增殖和扩散，使畜体重新患病。因此，BoHV-1感染牛病愈后，有可能依旧携带有该病毒。除此之外，羚羊、糜鹿、角马、水貂等多种野生动物都是携带BoHV-1的主要宿主动物，它们不表现BoHV-1的临床症状却携带并扩散该病毒，因此该病极难完全清除[12，13]。

1 临床诊断

BoHV-1主要包括呼吸道亚型和生殖道亚型2类。当动物被病毒感染后，患病动物会根据侵染病毒的亚型表现出对应的临床表现，主要临床症状为发热、口鼻和气管黏膜出现炎症反应、剧烈咳嗽和呼吸困难等，部分动物同时表现出结膜炎、脑炎、阴道炎、母牛流产及死胎等症状[14]。除此之外，BoHV-1侵染机体后在机体内会呈现潜伏感染的状态，存在于各种神经节和神经细胞中，在应激反应的刺激下会重新向外部排除病毒体，使其再次成为传染源，因此BoHV-1极难进行有效的防治和根除。虽然可以根据患病动物的临床症状和病理解剖对BoHV-1进行初步诊断，但无法明确诊断，因此必须采取病原学诊断和血清学诊断等方法对BoHV-1进行确诊，以便后续的精准治疗。

2 病原学检测

BoHV-1的病原学诊断技术主要包括电镜检查、病毒分离鉴定实验和多种分子生物学检测方法等。病原学诊断具有特异性强、准确性高、敏感性强等特点。其中，以核酸为主要检测基础的分子生物学检测方法是通过对目标的特异性片段进行诊断，结果准确率高，因而在实验室和实际应用中均得到了广泛使用。

2.1 电镜观察 根据BoHV-1所引起的疾病类型的不同从而收取患病动物不同组织的粘膜液负染后进行电镜检查是一种相对可靠的方法，也可以使用抗BoHV-1的高免血清使病毒粒子在体外形成特异性凝集现象，从而有助于电镜观察确诊。杨盛华等[15]利用电镜对BoHV-1进行过观察。但是，电镜观察采集的病毒样品不能经过反复冻融，也不能添加有机溶剂处理，否则会损伤病毒粒子表面的蛋白，从而使病毒丧失表面特征，不利于病毒粒子的辨认。在电镜视野范围内，BoHV-1病毒粒子直径为150～200nm，为圆球状，最外层为一层脂质囊膜，囊膜表面含有多个结构蛋白凸起，整体如花粉状。但是，相较其他方法而言，使用电镜观察BoHV-1，具有价格昂贵、操作复杂、时间较长等缺点，并且对操作人员的实验技巧有一定的要求，因此目前很少使用。

2.2 病毒分离鉴定 临床检测上，根据患病動物不同的发病症状，需要收集不同的组织样品：患有鼻气管炎的病畜需要使用棉棒采集病畜的鼻粘膜液和眼粘膜分泌液;患有传染性外阴阴道炎的患病母牛需要使用棉棒擦拭或者生理盐水冲洗采集外阴部黏液和阴道分泌物，患病公牛则需要使用生理盐水冲洗采集包皮内侧分泌物和患病公牛的精液;患病流产母牛需要采集死胎的粘膜液和实质脏器;患有脑炎的病畜需要采集部分脑组织[16]。

BoHV-1的病毒分离鉴定主要是利用牛肾或睾丸的单层细胞、牛肾传代细胞（MDBK）对临床上采集的病毒样品进行一定的处理，从而进行分离和鉴定。一般标准MDBK细胞接毒后2～5d就会产生明显的细胞病变效应（Cytopathic effect，CPE）。当细胞形态发生改变，逐渐变圆缩小、聚集成团并出现明显的细胞病变时，就基本可以确诊为BoHV-1感染。但是，由于病毒的分离过程较复杂、耗费时间较长、对实验设备要求较高且容易出现污染等缺点，因此BoHV-1的病毒分离鉴定只能作为实验室诊断方法之一，在实际生活中基本不使用[17]。Terpstra等[18]采集病牛的鼻粘膜液并使用直接荧光抗体法对其进行检测，结果表明在接种后2～8d全部人工感染牛均检测到了病毒粒子。之后，免疫酶实验和放射免疫测定也被用于BoHV-1的检测，但由于这些方法敏感性低、耗时耗力且易受各种不确定因素的影响，无法被广泛应用。

2.3 分子生物学诊断 BoHV-1的核酸检测方法主要有多种聚合酶链式反应以及脱氧核糖核酸杂交检测技术。分子生物学方法通过一定的技术手段在体外对目标基因片段DNA进行快速扩增，从而进行检测确认。与其他病原学检测方法和血清学检测方法相比较而言，分子生物学方法具有检测速度快、准确性高、特异性强等优点，因此在各领域都具有广泛应用。

2.3.1 聚合酶链式反应（PCR） 1993年Englenburg等[19]开始使用PCR技术对BoHV-1进行检测。此后，多位研究人员研究并建立了BoHV-1的聚合酶链式反应检测方法。王嵩等[20]根据NCBI网站GenBank数据库中已有的BoHV-1 gB基因设计引物，对退火温度等条件进行多次优化后建立了一种快速检测BoHV-1的PCR方法。林梅等[21]根据BoHV-1 tk基因序列建立了的BoHV-1 PCR检测方法，可用于养殖场BoHV-1防控检测手段。

2.3.2 巢式聚合酶链式反应（Nested-PCR） 巢式聚合酶链式反应是一种通过2次相继进行的聚合酶链式反应共同组成的一种PCR技术，因为2次PCR在首次PCR反应产物的基础上进行了再次的迅速扩增，因此Nested-PCR的特异性和成功率大大提高。SA Masri等[22]通过实验条件的优化，利用Nested-PCR成功检测BoHV-1感染公牛精液中的BoHV-1病毒。对于常用于牛人工授精的精液，PCR测定法检测到精液中的BoHV-1较病毒分离方法特异性强、敏感性高、准确性高。

2.3.3 LUX新型荧光PCR（LUX-PCR） LUX新型荧光PCR的基本原理是设计1条带有末端回文结构，并在3′末端标记荧光素的荧光定量PCR特异性单标引物。在游离状态下，这条引物可形成发夹结构，而这种带有末端回文结构的核酸构象本身具有淬灭荧光基团的功能特性，因此不需要在另一端标记淬灭基团。LUX利用这种标记荧光素的特异性单标引物的内在特性，从而更加简单地对待测目的基因实时荧光定量检测。当特异性单标引物和模板片段配对开始进行复制时，发夹打开，释放荧光，荧光信号显著增加，可以用机器进行定量[23]。陈茹[24]使用该方法检测BoHV-1，全程仅需约2h，敏感性高，可用于临床快速检测BoHV-1病毒。

2.3.4 实时荧光定量PCR（Real-time PCR） 实时荧光定量PCR是一种使用荧光物质实时测定每次PCR扩增后产物总量并依靠内参或外参对待测样本中含有的目的片段进行定量分析检测。实时荧光定量PCR技术的基本原理是将标记有荧光素的Taqman探针加入到PCR扩增体系中，遵守PCR的基本规律从而完成PCR扩增过程。当目的片段开始扩增时，Taqman探针和与其互补配对结合的模板DNA分开，在特定光下发出荧光;随着循环次数增加，被扩增的目的片段指数增长[25]，通过检测不同时间点增强的荧光信号强度即可求得Ct值;同时利用多个标准品作为实验对照，即可得出最终待测样品目的基因的具体拷贝数。Chandranaik BM[26]等通过间接ELISA方法和病毒分离对比检测精液和拭子临床样本中的BoHV-1，发现实时PCR测定法具有100%的灵敏度和87.19%的特异性。

2.3.5 核酸探针检测 核酸探针普遍带有发光或放射性标记物，是一种可以被检测到的已知具体序列的核酸片段，它可以结合到与其能相互配对的核酸序列上形成双链，因此可被用于检测含有特定核酸序列。针对某种病毒独有的核酸片段并对其进行一定的改造和标记，这些核酸片段就能制备出可以检测该病原体的探针。近年来，核酸探针已被广泛应用于各种细菌真菌和病毒检测，为流行病学的调查研究和临床诊断提供了一定的方法和检测依据。吴时友等[27]从纯化的BoHV-1提取全基因组，并使用32P对其进行标记改造制作可以检测BoHV-1的探针，进而进行点杂交实验。试验结果显示，探针具有较强的特异性和敏感性，能明显区分细胞是否被BoHV-1感染。随后实验证明，生物素也可以替代32P，制备的探针效果良好。非放射性同位素标记的探针可以在-20℃的条件下保存1年以上，不仅可以减少放射性同位素探针对人体造成的伤害，还有利于推广和应用，是一种不错的选择[28]。

2.3.6 重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA） 重组酶聚合酶扩增技术是近年来发现的一种通过可以结合单链核酸的重组酶、单链结合蛋白和链置换DNA聚合酶相互作用、协同完成的，与PCR具有相同功能的核酸检测技术[29]。RPA技术的基本原理是先使用可以结合单链核酸的重组酶与引物结合复合物，之后该复合物能够在双链DNA中寻找并定位同源序列进而启动同源序列的合成，对目标片段进行扩增。由于3种物质的相互配合，整个合成过程速度很快，大约10min便可检测出扩增产物。RPA引物比一般PCR引物长，一般要达到35个碱基，因此扩增引物和探针的设计对于RPA来说尤为重要。引物的变性温度不是影响扩增引物的关键因素。引物太短会导致重组率降低，对于目的片段的扩增速度和检测目的片段的灵敏度都具有较大影响[30-31]。Peili Hou、王红梅等[32]以BoHV-1的特异性保守UL52区片段设计引物和探针，使用重组酶聚合酶扩增技术成功检测BoHV-1，且BoHV-1 LFD-RPA与实时PCR之间的一致性为100%。

3 血清学检测

3.1 中和试验 中和试验是BoHV-1常用且经典的的血清学诊断方法，是世界动物卫生组织（OIE）规定的国际贸易检测方法之一，同时也是我国动物检疫的常用检测方法[33]，适用于各种流行病学调查。BoHV-1中和实验的基本原理是将经过倍比稀释的待检血清和已经测得病毒滴度的标准BoHV-1中和反应后接种于已经培养状态良好的96孔板中的MDBK细胞中，之后培养观察，若出现BoHV-1特异性细胞病变，则说明该血清样品为BoHV-1中和抗体阳性，同时还可根据抑制MDBK细胞出现细胞病变的血清最终稀释浓度计算出血清的中和抗体滴度[34]。由于中和试验步骤复杂、时间较长且容易受到其他因素影响，导致结果并不准确，因此在BoHV-1的临床检测时一般不使用中和实验，多使用酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assays，ELISA）进行检测。

3.2 酶联免疫吸附试验（ELISA） 酶联免疫吸附试验是一种利用结合于固体承载物上的抗原抗体的专一结合特性的检测技术。因其具有操作简便、敏感快捷、标准化程度高等优点，因此在多个行业中得到迅速发展和广泛应用，在BoHV-1的临床诊断和检疫检测中发挥着举足轻重的作用。通常，人们使用免疫原性良好的的BoHV-1囊膜糖蛋白（如gB、gC、gD、gE、gG等糖蛋白）作为诊断靶蛋白来建立BoHV-1抗原抗体检测ELISA。gB糖蛋白是BoHV-1在宿主细胞中病毒增殖过程中不可或缺的蛋白。曹翀等[35]成功纯化gB糖蛋白，建立并优化了间接ELISA检测BoHV-1。目前，市场上已有标准商品化的gB糖蛋白阻断ELISA检测试剂盒并投入使用。gC糖蛋白是在病毒囊膜表面和感染细胞膜上表达量最多的糖蛋白，免疫原性良好，能够引起体液免疫和细胞免疫。马辉等[36]成功表达和纯化了BoHV-1 gC糖蛋白，并制备了gC糖蛋白的单克隆抗体，以此为基础建立了BoHV-1双抗体夹心ELISA检测方法。gD糖蛋白是BoHV-1免疫原性最好的糖蛋白，能够诱导机体发生体液免疫应答和细胞免疫应答，常被作为亚单位疫苗的首选蛋白[37]。周跃辉[38]成功表达和纯化了BoHV-1 gD蛋白，并制备了gD糖蛋白的单克隆抗体，以此为基础建立了BoHV-1双抗体夹心ELISA。gE糖蛋白与病毒在宿主体内顺行和神经毒性密切相关，是中和抗体的主要靶蛋白之一，目前已经建立了以gE糖蛋白作为诊断靶蛋白的gE糖蛋白阻断BoHV-1诊断方法[39]。gG糖蛋白也具有很强的免疫原性。王冰[40]以纯化的gG糖蛋白制备单克隆抗体，以此为基础建立了BoHV-1竞争ELISA检测方法，对于BoHV-1的流行病学调查具有重要应用价值和意义。2016年Casarin E等[41]建立了一种以抗生物素蛋白—核酸组装体（avidinnucleicacidnanoassembly，ANANAS）为基本反应底物的新型ELISA。与传统的ELISA相比，ANANAS技术最显著的区别是将由辣根过氧化物酶标记抗体替换成了使用生物素蛋白-HRP标记抗体，这是一种纳米级的胶状抗生物素蛋白，并且可以将免疫信号放大从而应用于免疫诊断[42]。

3.3 琼脂扩散试验 琼脂扩散试验的基本原理为可溶性抗原与相应抗体在含有电解质的半固体凝胶（琼脂或琼脂糖）中可以发生沉淀反应，既可以利用BoHV-1来检测血清中是否含有抗体，也可以利用BoHV-1阳性血清來检测组织中是否含有BoHV-1。1993年Suresh S[43]在前人研究基础上建立了免疫扩散和对流免疫扩散检测BoHV-1的方法。该方法操作简单，成本较低，但敏感性不强，不适用于BoHV-1的临床诊断。

4 展望

隨着我国规模化养殖业的发展，BoHV-1的流行及其对养牛业的威胁也日趋严重，对于BoHV-1的根除或控制计划势在必行。随着科学技术的发展和进步，该病的诊断方法也在不断完善，各种快速有效的临床诊断方法也得到了广泛应用，但不同的诊断方法都有其优点和不足，实际应用中还应因地制宜选择合适的诊断方法。自从BoHV-1发现以来，人们一直在探寻更加简便、快捷、精准的临床诊断方法。病毒分离方法时间长且易受外界因素影响。核酸检测技术形式多样、灵敏度高、特异型强，但对于仪器和操作人员要求较为严格。中和试验、间接血凝试验、琼脂扩散试验以及酶联免疫吸附试验等血清学诊断方法具有简便、快速等优点，但由于BoHV-1具有潜伏感染的特性，因此即使牛群血清抗体阴性，仍难以保证牛群就没有BoHV-1感染。新材料，新技术的发展推动了新仪器和新的诊断技术的产生，随着科学技术的不断发展，根除BoHV-1的计划终将成为现实。

参考文献

[1]王单晶.牛传染性鼻气管炎阻断ELISA抗体检测方法的建立与应用[D].武汉：华中农业大学，2013.

[2]马瑜，孟红.单纯疱疹病毒侵入相关糖蛋白的研究进展[J].国际病毒学杂志，2006，13（3）：94-96.

[3]Varela A P M，Holz C L，Cibulski S P，et al. Neutralizing antibodies to bovine herpesvirus types 1（BoHV-1） and 5（BoHV-5） and its subtypes.[J]. Veterinary Microbiology，2010，142（3-4）：254-260.

[4]姜良，黄秀芬，王天坤，等.牛疱疹病毒1型gE蛋白胞外区基因的杆状病毒表达及其表达产物的免疫反应性[J].中国兽医科学，2014（9）：915-920.

[5]王丽荣，董永军，姚四新.牛传染性鼻气管炎病毒病的病原学及诊断[J].猪业科学，2004，21（3）：60-61.

[6]孟日增，石建平，肖成蕊，等.牛传染性鼻气管炎（IBR）诊断方法研究进展[C]//吉林省畜牧兽医学会2007学术年会论文集，2007.

[7]加尔肯，刘建华，冉多良.牛布鲁氏菌和牛疱疹病毒双重PCR检测方法的建立[J].畜牧兽医科技信息，2013（7）：21-22.

[8]周泰冲，叶章明，黎少权，等.从新西兰进口奶牛中分离传染性牛鼻道气管炎病毒[J].中国兽医科技，1981（1）：8-11，2.

[9]封启民，杨冰清，李昌琳，等.我国牛传染性鼻气管炎血清抗体普查报告[J].中国动物检疫，1982（00）：40-43.

[10]张小龙，汤贝贝，何玉凤，等.BALB/c小鼠作为单纯疱疹病毒1型感染模型的免疫学分析[J].微生物与感染，2017，12（4）：222-228.

[11]陈国花，邵洪运.牛传染性鼻气管炎的类型及诊治[J].现代畜牧科技，2011（6）：104-105.

[12]殷震，刘景华.动物病毒学[M].2版.北京：科学出版社，1997：1019-1020.

[13]王永艳，王仲兵，郑明学，等.牛传染性鼻气管炎的流行与防控[J].动物医学进展，2010，31（1）：112-115.

[14]Puentes R，Campos F S，Furtado A，et al. Comparison between DNA Detection in Trigeminal Nerve Ganglia and Serology to Detect Cattle Infected with Bovine Herpesviruses Types 1 and 5[J]. Plos One，2016，11（5）：e0155941.

[15]杨盛华，武银莲，邹啸环，等.动物3种DNA病毒在宿主细胞内形态发生比较[J].中国兽医学报，1992（1）：60-64.

[16]Deim Z，Szeredi L，Egyed L. Detection of bovine herpesvirus 4 DNA in aborted bovine fetuses[J]. Canadian journal of veterinary research=Revue canadienne de recherche vétérinaire，2007，71（3）：226-229.

[17]宋文超，金业，吴文浩，等. 传染性牛鼻气管炎病毒分离鉴定及特性分析[J].畜牧与兽医，2012，44（6）：31-34.

[18]Terpstra C. Diagnosis of infectious bovine rhinotracheitis by direct immunofluores-cence[J]. Tijdschrift Voor Diergeneeskunde，1979，104（14）：suppl 138-144.

[19]Chowdhury S I. BHV-1 gene-deleted virus vaccine：EP，US6284251[P]. 2001.

[20]王嵩，林红丽，王宇鹏，等.牛传染性鼻气管炎病毒PCR检测方法的建立及初步应用[J].黑龙江八一农垦大学学报，2014（3）：26-29.

[21]林梅.上海地区牛传染性鼻气管炎感染情况调查及病毒分离鉴定[D].南京：南京农业大学，2014.

[22]Masri S A，Olson W，Nguyen P T，et al. Rapid detection of bovine herpesvirus 1 in the semen of infected bulls by a nested polymerase chain reaction assay[J]. Canadian journal of veterinary research=Revue canadienne de recherche vétérinaire，1996，60（2）：100-107.

[23]陈茹，刘琳琳，曾彩云，等.牛疱疹病毒Ⅰ型二重LUX荧光PCR鉴别检测方法的建立[J].中国兽医科学，2007，37（11）：944-949.

[24]陈茹，毕英佐，曹永长，等.牛传染性鼻气管炎病毒LUX^TM新型荧光PCR检测方法的建立[J].中国预防兽医学报，2007，29（4）：303-307.

[25]Pawar S S，Meshram C D，Singh N K，et al. Development of a SYBR Green I based duplex real-time PCR for detection of bovine herpesvirus-1 in semen[J]. Journal of Virological Methods，2014，208：6-10.

[26]Chandranaik B M，Rathnamma D，Patil S S，et al. Development of a probe based real time PCR assay for detection of bovine herpes virus-1 in semen and other clinical samples[J]. Indian Journal of Virology，2013，24（1）：16-26.

[27]吴时友，吴明杰，宫云浩.应用～（32）P标记核酸探针检测牛传染性鼻气管炎病毒的研究初报[J].中国兽医杂志，1988（5）.

[28]罗文永，胡骏，刘文华，等.核酸探针中放射性同位素的快速检测[J].中国细胞生物学学报，2004，26（3）：324-326.

[29]高威芳，朱鹏，黄海龙.重组酶聚合酶扩增技术：一种新的核酸扩增策略[J].中国生物化学与分子生物学报，2016，32（6）：627-634.

[30]樊晓旭，赵永刚，李林，等.重组酶聚合酶扩增技术在疾病快速检测中的研究进展[J].中国动物检疫，2016，33（8）：72-77.

[31]景志刚，董浩，狄栋栋，等.重组酶聚合酶扩增技术研究进展[J].生物技术通报，2016，32（6）：47-53.

[32]Hou P，Wang H，Zhao G，et al. Rapid detection of infectious bovine Rhinotracheitis virus using recombinase polymerase amplification assays[J]. Bmc Veterinary Research，2017，13（1）：386.

[33]House J A，Baker J A. Bovine herpesvirus IBR-IPV. The antibody virus neutralization reaction[J]. Cornell Veterinarian，1971，61（2）：320.

[34]Donofrio G，Cavirani S，Vanderplasschen A，et al. Recombinant Bovine Herpesvirus 4 （BoHV-4） Expressing Glycoprotein D of BoHV-1 Is Immunogenic and Elicits Serum-Neutralizing Antibodies against BoHV-1 in a Rabbit Model[J]. Clinical & Vaccine Immunology，2006，13（11）：1246.

[35]曹翀，曹永生，宋林，等.牛传染性鼻气管炎病gB蛋白的截短表达及间接ELISA方法的建立[J].中国预防兽医学报，2015，37（2）：123-127.

[36]马辉，边传周，王永芬，等.牛传染性鼻气管炎病毒gC蛋白单克隆抗体的制备与初步應用[J].畜牧兽医学报，2013，44（10）：1637-1644.

[37]李汉雄，刘瑞宁，张芳，等.重组病毒BoHV-1gG^-/tk^-/gD^+和BoHV-1gG^-/tk^-/gD5^+的兔体内安全性和免疫原性[J].微生物学通报，2017，44（12）：2967-2980.

[38]周跃辉.牛传染性鼻气管炎病毒糖蛋白gD单抗制备及其抗原表位鉴定与双抗夹心ELISA的建立[D].北京：中国农业科学院，2015.

[39]Earley B，Tiernan K，Duffy C，et al. Effect of suckler cow vaccination against glycoprotein E（gE）-negative bovine herpesvirus type 1（BoHV-1） on passive immunity and physiological response to subsequent bovine respiratory disease vaccination of their progeny[J]. Research in Veterinary Science，2018：43-51.

[40]王冰.针对gG基因的牛传染性鼻气管炎病毒新型检测方法建立和应用[D].武汉：华中农业大学，2011.

[41]Casarin E，Lucchese L，Grazioli S，et al. A New ELISA Using the ANANAS Technology Showing High Sensitivity to diagnose the Bovine Rhinotracheitis from Individual Sera to Pooled Milk[J]. Plos One，2016，11（1）：e0145912.

[42]Casonato A，Pontara E，Morpurgo M，et al. Higher and lower active circulating VWF levels： different facets of von Willebrand disease[J]. British Journal of Haematology，2015，171（5）：845-853.

[43]Suresh S.Detection of BHV-1 in bovine by immunodiffusion and counter immunoelectrophoresis test[J].J Bombay VetCollege，1993，4：37-40.

（责编：徐世红）