许晨霞 余学高 黄浩 林少宾 陈培松*

（1.中山市博爱医院产前诊断中心，广东中山 528400；2.中山大学附属第一医院检验科，广东广州 510080；3.中山大学附属第一医院胎儿医学中心，广东广州 510080）

无创产前检测目前已广泛用于13、18、21-三体筛查，灵敏度及特异度均达到99%［1，2］。胎儿的游离DNA（cell-free DNA，cf DNA）已被证实仅起源于低甲基化的胎盘组织，而母体cf DNA来源于甲基化的造血和肝组织［3，4］。在母体血液中自由循环的DNA，绝大部分来自于母体本身，胎儿游离DNA（cell-free fetal DNA，cff DNA）的平均浓度为10%～15%，变化范围可达3%～30%［5］。cff DNA筛查要求胎儿游离DNA浓度不能过低，即母体血液中来源于胎儿的cf DNA的比例不能过低，小于3%或4%的样本是不合格的［6］。无创产前检测（noninvasive prenatal testing，NIPT）技术逐步由第三方检测机构转化到医院平台，运用医院平台为孕产妇做检测更重要的是能够根据妊娠结局的随访情况与临床医生沟通，使医生能更科学合理的为孕产妇做产前咨询。然而，不论是使用何种平台检测，都不可避免出现临界风险灰区（gray-area）病例。迄今为止，这些病例的妊娠结局并没有引起大家太多的关注。本研究的目的在于回顾性分析灰区病例的妊娠结局，初步探讨灰区结果可能的原因以及临床价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象 2017年3月至2020年7月，在中山大学附属第一医院分子诊断中心做NIPT检测的孕妇，检测结果在临界风险值范围T13（3.0＜Z＜4.39）；T18（3.0＜Z＜4.64）；T21（3.0＜Z＜5.08）的病例。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 研究方法 采集孕妇静脉血5ml，采血用EDTA-K2管4℃保存8h。3500rpm 4℃离心10min分离血浆，分离后的血浆于16 100g 4℃离心10min。采用磁珠法（中山大学达安基因生产的核酸提取试剂盒）提取孕妇血浆中的cf DNA。文库质检试剂及试剂盒（上海立菲生物技术有限公司：高灵敏度荧光染料DNA检测试剂盒；安捷伦科技有限公司：高敏感度DNA芯片）。文库构建步骤包括末端修复、DNA片段加接头、PCR扩增DNA片段。文库定量、上机测序、质控标准等流程后数据分析得到Z值。采用DA8600 proton平台（the ion proton semiconductor sequencing platform）进行半导体测序法检测。

结果判读：检测结果Z值T13（Z＞4.39）、T18（Z＞4.64）、T21（Z＞5.08）明确判断为高风险；T13（3.0＜Z＜4.39）；T18（3.0＜Z＜4.64）；T21（3.0＜Z＜5.08）样本为灰区样本，需要进行重复检测；Z≤3为低风险。第2次重新建库后检测结果仍然落在灰区的样本建议孕妇进行侵入性产前检查明确诊断；Z＜3为低风险，超声定期监测，进入常规孕检流程。

1.3 介入性产前诊断 为上述NIPT重复检测Z值2次均落在灰区的孕妇提供遗传咨询，经知情同意后进行羊水或者脐血穿刺G显带染色体核型分析，以及染色体微阵列分析（chromosomal microarray analysis，CMA）。

1.4 妊娠结局的随访 对NIPT检测Z值落在灰区的病例进行产后随访和生产时的详细病历记录查询，了解孕产妇本身的身体状况和新生儿出生时的健康情况。

2 结果

2.1 74 例灰区病例重复检测 2017年3月至2020年7月总共4883例孕妇中第1次检测，74例样本因所得Z值落在灰区而需要进一步验证，其中包括10例13-三体、12例18-三体、52例21-三体的灰区病例（图1）。将上述样本重新建库加大测序深度重新检测74例灰区病例中有7例Z值仍然在灰区范围。我们建议2次Z值灰区的孕妇行侵入性 产前检测。

图1 2次检测的结果

2.2 2 次检测Z值均落在灰区病例的分析 加大测序深度后检测Z值落在灰区的7例病例中，18-三体灰区2例（其中有1例失访），21-三体灰区5例。以上孕妇经知情同意后进行羊水或者脐血穿刺行G显带染色体核型和染色体微阵列分析。结果1例21-三体，1例21-三体24%的嵌合体，1例新生儿心脏畸形，其余病例染色体核型和染色体微阵列分析未见异常（表1）。

表1 第二次检测21、18三体灰区病例新生儿情况及Z值

2.3Z值灰区的74例病例进行孕妇自身情况和结果分析 产妇平均年龄为34.5岁，其中大于35岁的有38例（51%，38／74）。12～13＋6周36例，14～27＋6周36例，2例孕周大于28周。表2中可知，增大测序深度后，13、18、21-三体的Z值平均值较第一次检测结果相比明显下降，而cff DNA的平均浓度并没有随着唯一匹配读数（unique reads，UR）增加而增加。

表2 74例灰区病例2次检测结果的对比

2.4 灰区病例再次检测Z＜3病例的妊娠结局分析 第一次检测Z值落在灰区，而加大测序深度再次检测Z＜3的阴性病例67例，44例有产后随访结果，2例失访。这44例灰区病例中高危儿11例，所占比例高达25%；早产儿8例，所占比例20.4%。

表3 临界风险区新生儿情况

3 讨论

灰区是NIPT检测中常见的情况，对于灰区标本的临床处理流程目前尚无指南，且临床意义未知。2017年3月至2020年7月期间，在中山大学附属第一医院行NIPT检测的4883孕妇中发现74例灰区病例，占总数据的1.5%。加大测序深度复查后，有67例（90.5%，67／74）检测结果为低风险免于侵入性产前检测。由于NIPT检测的准确度和测序深度存在较大的关联，因此我们以第二次检测的结果为准。重复检测虽然能降低13、18、21-三体的假阳性率，但当出现Z值落在灰区时临床医生应该详细追踪随访其妊娠结局。对于灰区复查阳性的7例病例中，1例21-三体、1例21-三体24%的嵌合体，说明对于灰区重复检测能够避免漏掉一些真阳性病例。在NIPT检测中，国内外有很多研究把更多注意力放在实验的检出率、阳性预测值、漏检率等方面，而往往忽视了灰区病例的妊娠结局。许多生物学因素可导致NIPT检测结果与G显带染色体核型分析结果不一致，有时是胎儿因素，也可能由于母体本身的原因。关于胎儿的因素包括胎儿部分重复或缺失、限制性胎盘嵌合和双胎消失综合征等［7-9］。研究表明孕期的肿瘤DNA片段直接进入血液循环，从而影响NIPT的检测结果［10-12］。常见的良性肿瘤如子宫肌瘤也会将DNA释放到血液中［13，14］，这些肿瘤游离DNA使得与参照DNA之间的预期比例偏移。维生素B12或叶酸缺乏、器官移植、自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮也可能导致血浆中DNA的变化［15，16］。母体本身的染色体结构异也会导致NIPT结果异常。当检测值落在灰区时，我们应该进一步研究导致的Z值上升的具体原因。研究报道2010年全球的早产发生率为11.1%，2014年为10.6%［17］。我国不同地区早产发生率在4.49%～9.90%，最新的研究表明，中国活产早产率为6.70%［18］。对于妊娠结局的随访，我们发现44例灰区病例中高危儿11例，所占比例高达25%；早产儿8例，所占比例20.4%，这远超出普通人群的早产发生率。44例随访记录中25例产妇在生产时胎儿状况不良，甚至有3例孕妇发生自然流产。因此对于灰区病例特别是NIPT检测Z值两次都落在灰区，而G显带染色体核型分析正常的情况下，我不能单纯地解释为假阳性，这其中还涉及了一个不良的妊娠结局的风险。在表2中重新建库加大测序深度虽然UR增加，但是胎儿游离DNA浓度并没有随之增加，因此对于胎儿游离DNA浓度低于4%的孕妇建议4周后重新采血检测或者直接选择侵入性产前诊断尽快明确诊断。我们的研究发现灰区随访病例中有8例（18.1%，8／44）为IVF-ET术后双胎的病例，IVF-ET的双胎病例比自然受孕的双胎病例可能更容易使NIPT检测的Z值升高。染色体异常是导致不孕症的重要原因。近年来，有学者提出染色体多态性也是导致不孕症的重要因素［19］，因此选择辅助生殖技术的患者中最常见的就是夫妻双方或者一方有染色体异常情况。这种IVF-ET术后的病例是由于亲本的原因或者由于胎儿本身引起的Z值上升，我们还需要进一步的研究。灰区结果和不良妊娠结局之间是否有因果关系还要进一步的临床实验证实和更大的数据量进行研究。

我们的结果提示，当NIPT检测Z值在灰区时，应该引起实验室人员和临床医生的重视，一方面可能存在假阳性的问题，而另一方面孕妇不良妊娠结局的风险明显提高。