叶 乐,王海山,杨超杰,陈 治,胡清雨

1 热带海洋生物资源利用与保护教育部重点实验室(海南热带海洋学院),三亚 572022 2 海南省热带海洋渔业资源保护与利用重点实验室,三亚 572022

鱼类的形态特征信息是鱼类重要的分类依据之一,也是鱼类育种品种持续改良、利用和保护的前提[1],因此,采集鱼类形态特征信息是鱼类育种的重要基础工作。由于体质量是揭示生长性能最直接的指标,因而成为鱼类育种中重要的目标性状,但在实际操作中,特别是对于个体较小的鱼类,体质量的测定需要精确的仪器且对操作环境也有比较严格的要求,另外,由于体表水分的影响测量误差较大,所以,寻找更为准确快捷又与体质量密切相关的指标成为许多研究工作的目标。通径分析可以将基本变量的相关性分解成直接和间接影响,从而更好地理解这些性状之间关联的原因[2],为育种指标选取提供更可靠的依据。最近的研究表明,运用多元统计分析和通径分析,可以阐明菲律宾蛤仔(Ruditapesphilippinarum)[3]、凡纳滨对虾(Penaeusvannamei)[4]、克氏原螯虾(Procambarusclarkii)[5]、红蟹(Charybdisferiata)[6]、牙鲆(Paralichthysolivaceus)[7]、小黄鱼(Pseudosciaenapolyactis)[8]、斜带石斑鱼(Epinepheluscoioides)[9]和尖吻鲈(Latescalcarifer)[10]的形态性状与体质量的相关性,因而可以选择形态性状替换体质量指标达到选育的目的。研究表明,鱼类形态信息存在着种内差异,与生境[11-12]、性别[13]、生长发育阶段[7,14-15]相关。在自然生境中,鱼类常受到饥饿的胁迫,因此,饥饿引起鱼类生长、组织生理、代谢、行为等方面的影响研究是目前热点研究领域[16- 18],而饥饿对鱼类形态特征影响方面的研究相对匮乏[19]。

眼斑双锯鱼(Amphiprionocellaris)俗称公子小丑,是海葵鱼亚科(Amphiprioninae)即小丑鱼家族的一员,是重要的海水观赏鱼种类之一。小丑鱼人工繁殖已经可以量产,但许多研究工作尚待开展,目前国内对于眼斑双锯鱼的报道仅见胚胎发育[20]、营养[21-22]和药物应激生理[23]等方面,国外则多聚焦于性转化[24]、领域行为[25]和热应激[26]等问题。在小丑鱼生产中已经出现种质退化生长缓慢现象,有必要开展快速生长品系的选育工作。由于个体差异和人为因素,养殖过程中某些个体可能会较长时间处于饥饿状态,目前,饥饿对眼斑双锯鱼形态性状与体质量相关性的影响未见报道,是否对选育指标的选择有影响也尚未可知。因此,本研究通过表型相关的通径分析,研究饥饿对眼斑双锯鱼幼鱼形态性状与体质量的相关性影响,旨在评估饥饿和非饥饿状态下影响眼斑双锯鱼体质量的主要形态性状,及其各性状对体质量的直接作用、间接作用和决定作用,得出两种状态下体质量与形态性状的多元回归方程,为眼斑双锯鱼的选择育种工作提供参考资料、奠定理论基础,同时为眼斑双锯鱼生理生态学的研究积累基础资料。

1 材料与方法

1.1 实验材料与方法

实验于2019年12月在海南热带海洋学院实验室进行。实验鱼购自海南万宁小丑鱼繁殖场,选取同一批亲鱼产卵孵化培育的60d健康幼鱼,打包充氧带回实验室,在实验室暂养7d后随机分到实验养殖缸中。实验设饥饿组和对照组,每组3个平行,每组30尾。养殖缸为60 cm×40 cm×40 cm玻璃缸,对照组正常投喂,每日投喂2次,饥饿组不投喂,其余养殖条件一致,循环水养殖,每天采用7w全光谱Led灯光照12h,水温25—26℃。实验进行7d,实验结束后全部取样,然后采用MS- 222麻醉剂进行麻醉后拍照和测量体质量。

1.2 数据测量和分析方法

用吸水纸吸干实验鱼体表水分后用精度为0.001 g的电子天平测量体质量(W,g),接着在体视显微镜下对每条鱼进行正反面拍照,在电脑上用Image-Pro plus 6.0软件准确测量每一尾幼鱼的形态性状(mm),包括全长(L1)、体长(L2)、体高(L3)、头长(L4)、头高(L5)、吻长(L6)、尾柄长(L7)、尾柄高(L8)、背鳍前距(L9)、胸鳍前距(L10)、腹鳍前距(L11)、臀鳍前距(L12)、眼径(L13)等13个指标,精确至0.001 mm。

图1 形态指标测量示意图 Fig.1 Schematic diagram of morphological index measurementL1：全长,Total length；L2：体长,Standard length；L3：体高,Body depth；L4：头长,Head length；L5：头高,Head depth；L6：吻长,Snout length；L7：尾柄长,Caudal-peduncle length；L8：尾柄高,Caudal-peduncle depth；L9：背鳍前距,Pre dorsal length；L10：胸鳍前距,Pre pectoral length；L11：腹鳍前距,Pre pelvic length；L12：臀鳍前距,Pre anal length；L13：眼径,eye diameter

测量的形态性状指标如图1所示,为减少操作误差,所有样品鱼的形态指标由两人分别测定,每人对鱼体左右侧所有指标各测定一次,综合两人测定的4组数据取平均值作为最后数值用于统计分析。

运用IBM SPSS statistics 25软件对数据进行统计分析。计算各性状的平均值和标准差。各性状变异系数(CV)的计算公式：

CV=(标准差/平均值)×100%

先对因变量(体质量)进行正态性检验,检验合格后采用Pearson法对各形态性状与体质量进行相关分析; 在此基础上运用逐步引入-剔除法建立形态性状与体质量的多元线性回归方程,通过形态性状对体质量的通径系数和间接通径系数,分析各形态性状对体质量的直接作用和间接作用。

决定系数计算公式：

di=Pi2；dij= 2rij×Pi×Pj

式中,di是单个性状i对体质量的影响,dij是性状i和j对体质量的影响,rij是性状i和j之间的相关系数,Pi,Pj分别是单个性状i,j对体质量的通径系数。

2 结果

2.1 数据正态性验证

对因变量W(体质量)进行正态性检验,结果显示Shapiro-Wilk 显著性大于0.05,Kolmogorov-Smirnov显著性为0.200(真显著性下限),数据服从正态分布,可以对体质量与形态特征进行回归分析。

2.2 表型数据描述性统计

对眼斑双锯鱼幼鱼体质量和形态性状数据进行描述性统计,结果见表1。对照组和饥饿组变异系数最大的均为W(体质量)参数(32.651%和34.063),而形态性状中变异系数最大的是L6(吻长,25.486%和20.689%),最小的是L13(眼径,8.708%和7.339%)。

表1 表型性状的描述性统计

2.3 各性状间的相关性分析

对饥饿组和对照组眼斑双锯鱼幼鱼表型数据进行相关性分析,结果表明,各性状间均存在显著相关关系,达到极显著水平(P<0.01)(表2),说明形态性状对体质量以及这些性状之间存在线性相关。对照组形态性状对体质量相关系数的大小顺序(r)为L3>L2>L1>L9>L5>L10>L8>L12>L11>L4>L13>L6>L7,饥饿组形态性状对体质量相关系数的大小顺序(r)为L3>L1>L2>L5>L8>L4>L10>L12>L11>L9>L13>L6>L7。对照组和饥饿组中与体质量相关系数最高的性状均为体高,而其它形态性状与体质量相关系数排序两个组间存在一定的差别。

表2 表型性状之间的相关性分析及显著性检验

2.4 通径分析结果

对照组和饥饿组形态性状对体质量的通径系数见表3。剔除经共线性诊断共线性严重的变量和对体质量影响不显著的变量,对照组结果保留了L3、L2、L6和L5等4个形态性状变量,饥饿组结果保留了L3、L12、L2、L7和L6等5个形态性状变量,所选性状对体质量的影响达到极显著水平(P<0.01)。根据成分效应,相关系数可分为直接作用(通径系数)和间接作用(间接通径系数)两部分。对照组直接作用由大到小排序依次为：L3>L2>L6>L5,间接作用排序为：L5>L6>L2>L3；饥饿组直接作用由大到小排序依次为：L3>L2>L12>L6>L7,间接排序为：L7>L12>L2>L6>L3。可见,对照组和饥饿组中体高的直接作用均为最大(分别为0.718和0.574),间接作用均为最小,也是所筛选出的形态性状中唯一的间接作用小于直接作用的性状；第二大直接作用均为体长(分别为0.432和0.314)；对照组直接作用最小为头高(-0.276),对体质量影响呈负向作用,但其间接作用最大(1.184),饥饿组直接作用最小为尾柄长(-0.178),同样呈负向作用,其间接作用也最大(0.730)。

表3 相关系数分解

2.5 形态性状对体质量的决定程度

对照组和饥饿组各形态性状对体质量的决定系数分别见表4。表中,相同性状对应的数值为其对体质量的单独决定系数,两个不同性状对应的数值为它们对体质量的共同决定系数。从表中可看出,对体质量的单独决定系数由大到小排序对照组分别为L3>L2>L5>L6,饥饿组为L3>L2>L12>L7>L6,可见,对照组和饥饿组单独决定系数最大均为体高,其次为体长,单独决定系数最小均为吻长。对照组和饥饿组共同决定系数最大的均为L3L2,即体高和体长对体质量的共同决定作用最大。共同决定系数最小的对照组为L3L5(体高和头高)(-0.368),饥饿组为L3L7(体高和尾柄长)(-0.136),均为负向作用。两组体高的单独决定系数和与其它性状共同决定系数总和均为最高,说明不管鱼体饥饿状态如何,体高都是决定体质量最主要的因素。所有单独决定系数和两性状共同决定系数的总和为所筛选性状的总决定系数,对照组为0.930,饥饿组为0.941。由总决定系数计算剩余因子,对照组e=0.2638,饥饿组e=0.2310,说明两个实验组体质量决定因子除了筛选出的上述形态性状外,还有其它影响较小的因子。

2.6 多元回归方程构建

通过多元回归分析,剔除经共线性诊断共线性严重的变量和对体质量影响不显著的变量,分别建立了对照组和饥饿组形态性状与体质量关系的多元回归方程：

W=-0.819+0.106L3+0.027L2+0.006L6-0.050L5(R2=0.941,F=267.294,P=0.000)；
W=-0.778+0.078L3+0.016L12+0.015L2-0.055L7+0.018L6(R2=0.930,F=267.294,P=0.000)。

上述回归方程多重相关系数(R2)均大于0.85,表明所选的形态性状分别是影响对照组和饥饿组眼斑双锯鱼幼鱼体质量的关键因子。F检验结果显示,上述回归方程的回归关系均达极显著水平(P=0.000<0.01)；t检验结果显示,上述回归方程的形态性状对体质量的偏回归系数均达显著或极显著水平(P<0.01或(P<0.05) (表5),所以总体回归方程是显著的。预测标准残差平均值及其标准差对照组为0.000±0.967,饥饿组为0.000±0.976,表明建立的多元回归方程较好的拟合了样本观测值。

表4 形态性状对体质量的决定系数

表5 模型的系数及其t检验结果

3 讨论

相关性分析表明,所测量的13个眼斑双锯鱼幼鱼形态性状与体质量均存在极显著相关关系(P<0.01),显然,仅用相关分析不能客观描述性状间的相互关系,不能把最重要的表型性状筛选出来。所以为了剔除不必要的指标,有必要进行通径分析,最终找出影响幼鱼体质量的主要关键性状。通径分析可以将自变量对因变量的总影响分为直接影响和间接影响,并能充分反映性状之间关联的原因[2]。一般来说,只有当自变量的表型相关系数达到因变量的显著水平时,才可以选择该自变量,否则,应将其排除在外[27]。在通径分析和决定系数分析中,当相关性状决定系数的总和(R2)大于或等于0.85时,表明找到主要自变量[28]。本研究未饥饿对照组和饥饿组分别筛选出4和5个形态性状,它们对体质量总的决定系数均大于0.85,表明眼斑双锯鱼体质量变异主要是由这些形态性状决定的,它们分别代表未饥饿和饥饿状态下直接或间接影响眼斑双锯鱼体质量的关键因子。

本研究发现,饥饿胁迫影响着眼斑双锯鱼幼鱼形态性状与体质量的相关性,在非饥饿状态下体高、体长、吻长和头高等4个形态性状是决定鱼类体质量的主要性状,而饥饿状态下体高、臀鳍前距、体长、尾柄长和吻长等5个形态性状是体质量主要的影响因子。此前研究表明,鱼类形态性状对体质量的影响存在种间差异,如对于二龄草鱼(Ctenopharyngodonidellus) 体宽是最主要因素[27]；转基因鲤则是体长和体高[28]；野生小黄鱼体长对体质量的影响最大[8]；而对于 4月龄斜带石斑鱼,全长是最主要因素[9]。种内不同生长阶段也存在明显差异,如6月龄大菱鲆(Scophthalmusmaximus),全长、体高、体厚和头长对体质量影响最大,而14月龄为全长、体厚和尾柄宽[14]；大泷六线鱼(Hexagrammosotakii)6月龄为体长、头长、体高和体宽,而18月龄则为全长、体高、尾柄高和体宽[15]。另外,种内形态性状还表现群体差异和两性异形,如罗非鱼(Oreochromisniloticus)[11]和丽体鱼属的Cichlasomafestae[12]的野生群体和人工养殖群体之间的形态性状均存在显著差异；鲶鱼(Silurusasotus)和胡子鲶(Clariasfuscus)形态特征存在两性异形[13],这些种内形态性状差异对其与体质量的相关性也可能有影响。目前已经证实环境因子对鱼类形态性状有影响,如曾令清等(2017)[29]研究发现鳊幼鱼表型特征之间存在关联,且受环境条件的影响。由于生存环境和人为因素常导致鱼类处于饥饿的胁迫状态,对其能量代谢和行为[18,30]、鱼体成分[31]、生理生化[32]、游泳能力[17,33]等产生显著影响。鱼类形态结构与机能是相协调的,因此饥饿状态下可能存在鱼体形态变化适应策略。研究发现,中华倒刺鲃(Spinibarbussinensis)仔鱼随着饥饿程度增加,体长和体高均显著下降[34],而鲤幼鱼饥饿后体高变化较其他参数明显,导致体高/体长明显下降,体型变得更加“细长”[19]。这种体型的变化可能是饥饿状态下肌肉营养物质大量消耗以维持生命造成的,但这种变化也可能有利于降低鱼类游泳过程中能量消耗[35],体现了鱼类对饥饿胁迫的形态适应。而本研究证实眼斑双锯鱼幼鱼对饥饿胁迫的形态适应,影响了其形态性状与体质量的相关性,但饥饿和非饥饿状态下的幼鱼也有共同的体质量决定因子,即体高、体长和吻长,其中体高在两种状态下都是最主要的决定因子。

为尽可能减少人为误差,许多形态测量研究取样的样本量都比较大,几百甚至几千尾,这样增加了工作量,另外形态测定时间过长难免造成鱼类死亡,本研究对常规测量方法做了改进,不采用游标卡尺现场测定,而是在使用麻醉剂麻醉后拍照,再用电脑软件测量,精确度高,而且对于同一批实验样本,采用2人测定正反面数据取平均值再统计,更进一步消除了人为误差,使得结果更为可信。同时可以减少取样量,实验鱼在拍照和测量体质量后即可放回水体中,用时极短,很大程度上减少测量操作造成鱼类的损伤。

4 结论与建议

本研究应用通径分析技术探索了饥饿和非饥饿状态下13个形态性状之间及其与体质量的相互依赖关系,有助于比较客观地分析和解释这些性状之间的相关模式。研究证实饥饿胁迫影响了眼斑双锯鱼幼鱼形态性状与体质量的相关性,但饥饿和非饥饿状态下体高、体长和吻长都是影响体质量的关键因子,因此不论眼斑双锯鱼幼鱼饥饿程度如何,可以均选择它们作为该鱼选育快速生长品系的重要参考性状,当然,这些形态计量性状应与遗传研究相结合,提供这些变量与体质量的遗传力和遗传相关性的信息。