大熊猫轮状病毒可视化LAMP 检测技术的建立及应用

2021-02-05蒋金蓁张白玉杨锐颜其贵

湖南农业大学学报(自然科学版) 2021年1期

蒋金蓁，张白玉，杨锐，颜其贵

(四川农业大学动物医学院，四川成都 611130)

王成东等[1]从大熊猫粪便中分离出1 株A 组轮状病毒(rotavirus，RV)，命名为大熊猫轮状病毒(GPRV) CH-1 株。GPRV 主要感染幼龄大熊猫(5～11月龄)，引起幼龄大熊猫腹泻甚至死亡。由于成年动物感染RV 多为隐性经过，并持久地向外界排毒，RV 对环境因子和许多常见消毒剂有较强抵抗力，导致某一地方发病，随后每年会连续发生[2]，这对大熊猫的繁育、健康及野化放归带来重大威胁。

目前，针对GPRV 已建立常规PCR[3]及荧光定量PCR[4]检测方法，具有特异、敏感、高通量等特点。曾杨茹等[5]使用上述2 种方法对2011、2012、2013、2015 年的共 227 份大熊猫粪便 GPRV 携带情况进行检测，利用荧光定量 PCR 检出阳性率为11%，而常规 PCR 检出阳性率仅为 6.6%。及早发现GPRV 感染，更早接受治疗，可降低病毒传播和死亡风险[6]。荧光定量PCR 对设备及实验条件要求过高，不能广泛推广；因此，加强对GPRV 感染的监测和开发简单、快速、高灵敏度的实验室诊断方法是当务之急。

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术是在等温(60～65 ℃)条件下，由2 对特异性引物针对靶基因的6 个不同区域进行特异性识别，在 DNA 聚合酶的作用下，短时间(通常少于1 h)内进行核酸扩增，其结果可直接肉眼观察[7-8]。研究[9]发现，在 LAMP 反应中加入环引物，能明显加快扩增速度，提高检测效率。本研究中，笔者根据GPRV CH-1 株VP4 基因设计引物，建立GPRV 可视化LAMP 方法，并对其反应条件进行优化，以期利用 LAMP 方法快速、有效的诊断GPRV 的早期感染和隐性感染。