闫 帅，李永玉*，彭彦昆，刘亚超，韩东海

1.中国农业大学工学院，国家农产品加工技术装备研发分中心，北京 100083 2.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083

引 言

表面增强拉曼散射(surface-enhancement of Raman scattering)是某些物质分子吸附到特定的金属表面时，该分子拉曼散射强度显著增强的一种现象[1]。表面增强拉曼光谱可以快速提取样品的指纹特征信息，无需制备特殊样品，广泛应用于农产品、食品[2-4]等安全、品质方面痕量甚至单分子的检测应用研究。但表面增强拉曼光谱信号重复性欠佳，定量分析局限于实验室固定检测条件下的应用研究，仍亟待发展完善[5]。

拉曼信号重复性受诸多因素的影响，如检测环境温度、被测物质与探针之间相对位置、检测器件的暗电流噪声、光源的输出功率稳定性等[6]。特别是表面增强拉曼信号重复性更差，不同批次的表面增强剂以及表面增强剂与样品的混合时间等均对拉曼信号强度影响非常大。为消除或减少上述的影响，诸多学者通过内标法进行了拉曼光谱定量分析研究，旨在提高定量预测模型的精度。刘江美[7]等通过加入硫氰化钾作为内标物对亚胺硫磷溶液进行表面增强拉曼光谱分析；房晓倩[8]等以硝酸钠1 053 cm-1处拉曼特征峰强作内标建立了山梨酸钾浓度预测模型并进行预测；Yu[9]等以丙酮为诱导物浸渍样品皮提取农药分子，并将丙酮的拉曼特征峰作为内标校准了拉曼信号波动。除此之外还有以四氯化碳、高氯酸根离子[10]、甲醇[11]等为内标物的相关研究报道。以上研究一定程度上减小或消除拉曼信号稳定性差的问题，提高了定量分析模型精度，但均引入了额外的内标化学物质。如果被测底物本身持有固有的内标峰，无需加入额外的内标物，可避免引入新内标时的人为误差，也可消除或减少拉曼信号重复性差的问题。

蜂蜜作为传统的营养保健食品，其品质安全备受关注。硝基呋喃类抗生素应用于治疗或预防蜜蜂的胃肠道疾病具有潜在残留风险。本文以蜂蜜中硝基呋喃妥因兽药为检测对象，利用实验室自行搭建的拉曼点检测系统，确认作为底物蜂蜜的固有内标峰，分析硝基呋喃妥因拉曼特征峰的归属，研究基于蜂蜜固有内标的硝基呋喃妥因表面增强拉曼特征峰强校正方法，建立蜂蜜中硝基呋喃妥因兽药残留的定量预测模型，旨在消除和减少仪器系统误差及表面增强过程中不可控因素引起的人为误差，为蜂蜜中兽药残留定量分析提供技术支撑。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

枣花蜂蜜购于北京市当地物美超市，用于制备含硝基呋喃妥因蜂蜜样品；硝基呋喃妥因(高纯，98%)购于上海源叶生物科技有限公司用于获取硝基呋喃妥因标准拉曼光谱和制备含硝基呋喃妥因蜂蜜样品；柠檬酸钠(分析纯，北京化工厂)和硝酸银(分析纯，广东光华科技股份有限公司)用于制备表面增强剂银溶胶。

拉曼光谱系统为实验室自行搭建的拉曼光谱点检测系统，包括Andor CCD相机(Andor Technology，Inc，South Windsor，Conn)，光谱仪(Head Wall Photonics，Fitchburg，Mass)：有效光谱范围0～2 344 cm-1，分辨率为2～3 cm-1，激光器波长785 nm (Innovative Photonic Solution，Monmouth Junction，N.J.)，计算机。

1.2 方法

银溶胶的制备：按照Lee[12]等的方法将1×10-3mol·L-1硝酸银溶液加热至沸腾，使用磁力搅拌器高速搅拌硝酸银溶液，并逐滴加入浓度为1%柠檬酸钠溶液，柠檬酸钠和硝酸银溶液体积比为1∶40，保持加热搅拌1 h，反应完成后自然冷却至室温。上述银溶胶置于台式离心机以3 000 r·min-1速度离心30 min，去除上清液获得浓缩银溶胶。将制备好的银溶胶放入4 ℃的冰箱中避光保存备用。

样品的制备：配制20 mg·kg-1的硝基呋喃妥因水溶液，与蜂蜜混合制备含有不同浓度硝基呋喃妥因蜂蜜样品。制备硝基呋喃妥因浓度范围为0.4～20 mg·kg-1的蜂蜜样品共69个，每个样品利用旋涡混合器将蜂蜜和硝基呋喃妥因水溶液混合均匀，每个浓度梯度的蜂蜜样品制备3个，其中2个作为校正集样品，1个作为验证集样品。为排除其他环境因素的干扰，所制备样品于4 ℃恒温冰箱中避光保存供后续采集光谱使用。

光谱采集与预处理：拉曼光谱系统激光波长为785 nm，设定激光功率150 mW，积分时间为1 s，用移液枪分别吸取2.5 μL蜂蜜样品和1 μL银溶胶，将两者充分混合后静置30 s采集光谱。所获光谱曲线数据利用MATLAB R2016b附带的PLS Toolbox数据库对其进行平滑降噪(Savitsky-Golay，Filter Width 5，polynomial order 1)和特征峰值提取，并利用Origin 2018进行标准曲线的绘制和计算分析。

2 结果与讨论

2.1 蜂蜜内标峰的确认及硝基呋喃妥因拉曼特征峰的归属分析

图1 硝基呋喃妥因标准品拉曼光谱(a)和含有硝基呋喃妥因蜂蜜的SERS光谱(b)Fig.1 Raman spectrum of nitrofurantoin standard products (a) and honey SERS spectrum (b) containing nitrofurantoin

为进一步确认739 cm-1拉曼特征位移处的拉曼特征信号，分别采集了含有不同浓度硝基呋喃妥因的蜂蜜样品的表面增强拉曼光谱。如图2所示，由于蜂蜜复杂的成分所造成的荧光背景，即使蜂蜜和纳米银颗粒接触吸附后，糖类物质的多数拉曼特征信号并没有得到增强，市售蜂蜜样品仅在739，1 033和1 399 cm-1处出现了拉曼特征峰。其中，1 399 cm-1拉曼特征位移和硝基呋喃妥因1 353 cm-1处拉曼特征位移非常相近，随硝基呋喃妥因浓度的增加蜂蜜的1 399 cm-1处特征峰越来越不明显。另外，1 033 cm-1处蜂蜜和硝基呋喃妥因拉曼特征峰几乎重叠，随硝基呋喃妥因浓度增加1 033 cm-1处特征信号强度逐渐递增，说明不便利用1 025 cm-1处硝基呋喃妥因特征峰强进行定量分析。只有蜂蜜的739 cm-1处拉曼特征峰不受硝基呋喃妥因影响，特征峰比较尖锐清晰。因此选定蜂蜜中739 cm-1处拉曼特征峰强作为内标，校正蜂蜜中硝基呋喃妥因的特征峰强用于蜂蜜中硝基呋喃妥因定量分析。

图2 基线扣除后含硝基呋喃妥因蜂蜜表面增强拉曼光谱Fig.2 Surface enhanced Raman spectra of honey containing nitrofurantoin after baseline deduction

2.2 内标校正效果及稳定性分析

表面增强拉曼光谱的信号主要受操作者的操作误差、仪器波动和光源功率波动影响，仪器波动变化难以预知，而人为操作难以保证增强剂与蜂蜜样品混合均匀性与吸附时间的一致性，同一样品所获取的拉曼特征峰强重复性和稳定性较差。相同条件下采集30次硝基呋喃妥因浓度为20 mg·kg-1的蜂蜜样品表面增强拉曼光谱，结果如图3(a)所示。1 353和1 612 cm-1处硝基呋喃妥因特征峰强相对标准偏差(RSD)分别为11.515 6%和11.162 5%，硝基呋喃妥因拉曼特征峰强波动显著。利用蜂蜜739 cm-1处拉曼特征位移信号作为内标，分别计算每个光谱1 353和1 612 cm-1处的硝基呋喃妥因特征峰强与蜂蜜739 cm-1处拉曼特征峰强的比值(I1 353/739，I1 612/739)，结果显示采集30次硝基呋喃妥因浓度为20 mg·kg-1的蜂蜜样品表面增强拉曼光谱的1 353 cm-1处硝基呋喃妥因拉曼特征峰强与739 cm-1处蜂蜜拉曼特征峰强的比值相对标准偏差为4.852 6%，1 612 cm-1处的硝基呋喃妥因拉曼特征峰强与蜂蜜739 cm-1处拉曼特征峰强的比值的相对标准偏差为4.733 2%，显著提升了表面增强拉曼特征峰强的重复性和稳定性，校准后的光谱如图3(b)所示。因为仪器系统误差及表面增强过程中不可控因素引起的人为误差等对样品表面增强光谱中739 cm-1处蜂蜜特征峰强和1 353和1 612 cm-1处硝基呋喃妥因特征峰强的影响是完全相同的，所以通过内标比值法可以有效消除和减少拉曼信号稳定性和重复性差的问题，可以提升定量分析模型精度。

图3 30条20 mg·kg-1硝基呋喃妥因蜂蜜的原始光谱(a)和使用739 cm-1处蜂蜜拉曼特征峰校准后的光谱(b)Fig.3 Raw spectra (a) of 20 mg·kg-1 nitrofurantoin honey and spectra (b) calibrated with Raman characteristic peaks at 739 cm-1

分别采集硝基呋喃妥因浓度为1，5，10，15和20 mg·kg-1的蜂蜜样品表面增强拉曼光谱，每个浓度重复采集5次，并利用蜂蜜中739 cm-1处拉曼特征峰值强度作为内标对硝基呋喃妥因拉曼特征峰强度进行了校正。校正前所有样品在1 353和1 612 cm-1处拉曼特征峰强平均相对标准偏差分别为12.418%和7.166%，经内标比值校正后相对标准偏差分别降至8.508%和3.808%。1 353 cm-1拉曼特征峰强相比于1 612 cm-1具有较大的相对标准偏差，可能是1 353 cm-1处硝基呋喃妥因拉曼特征峰比较接近蜂蜜本身1 399 cm-1处拉曼特征峰，加上受银溶胶中柠檬酸盐在1 400 cm-1的拉曼特征峰影响，但结果表明利用蜂蜜中739 cm-1处拉曼特征峰强校正后两拉曼特征峰强相对标准偏差显著减小。1 353和1 612 cm-1处硝基呋喃妥因拉曼特征峰强用内标比值法校正前后与蜂蜜中硝基呋喃妥因浓度的线性关系如图4所示。1 353 cm-1处拉曼特征峰强与硝基呋喃妥因浓度的决定系数R2为0.914，比值校正后决定系数R2为0.965 3；1 612 cm-1处拉曼特征峰强与硝基呋喃妥因浓度的决定系数为0.904 2，比值校正后决定系数为0.962 1。结果表明，内标比值校正法可以有效提高硝基呋喃妥因预测模型精度。

图4 内标校准前后硝基呋喃妥因浓度和1 353 cm-1(a)， 1 612 cm-1(b)处拉曼强度的线性关系Fig.4 Linear relationship between nitrofurantoin concentration and Raman strength at 1 353 cm-1 (a) and 1 612 cm-1 (b) before and after internal standard calibration

2.3 蜂蜜中硝基呋喃妥因定量预测模型的建立

制备硝基呋喃妥因浓度范围为0.4～20 mg·kg-1的蜂蜜样品69个，分别采集了表面增强拉曼光谱，如图5(a)所示。采集的每个光谱分别利用蜂蜜739 cm-1处拉曼特征峰强对硝基呋喃妥因1 353和1 612 cm-1处拉曼特征峰强进行了比值校正，结果如图5(b)所示。结果表明，利用蜂蜜中739 cm-1处拉曼特征峰强作为内标，校正硝基呋喃妥因拉曼特征峰强可以有效减小或消除因仪器波动、激光功率变化以及人为操作等因素差异对硝基呋喃妥因拉曼特征峰强的稳定性的影响。

图5 硝基呋喃妥因蜂蜜表面增强拉曼光谱(a)：校正前；(b)：校正后Fig.5 Surface enhanced Raman spectra of nitrofurantoin honey(a)：Before correction；(b)：After correction

表1 蜂蜜中硝基呋喃妥因定量预测模型Table 1 Quantitative prediction model of nitrofurantoin in honey

图6 1 612 cm-1校正前和校正后模型对比(a)：校正集；(b)：验证集Fig.6 Comparison of validation set models before and after correction of 1 612 cm-1(a)：Calibration set；(b)：Verification set

3 结 论