陈文强，汪小福，陈笑芸，彭 城，徐俊锋，蔡 健，*

(1.阜阳师范大学 生物与食品工程学院，安徽 阜阳 236037； 2.浙江省农业科学院 农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室(筹)，浙江 杭州 310021)

铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)是兰科树兰族石斛属多年生草本植物[1]，据最新版《中国药典》的记录[2]，其具有滋阴清热、生津养胃之功效。铁皮石斛中含有多种活性物质如多糖、生物碱、蛋白质[3]，以及人体所需的微量元素等，是较为珍稀的药用植物。铁皮石斛主要分布在我国南方地区，如浙江、云南、广西和安徽等地[4]。浙江由于独特的地理和气候环境，造就了铁皮石斛高品质的特性。如马旖旎[5]对不同区域的铁皮石斛成分进行分析发现，浙江产区的铁皮石斛多糖和黄酮含量较为丰富。浙江铁皮石斛产地分布广阔[6]，不同地区铁皮石斛质量也参差不齐；另外，铁皮石斛市场上也存在“以假乱真”“以次充好”等混乱现象，严重损害了消费者的正当权益，制约了铁皮石斛产业健康可持续性的发展，迫切需要建立快速精准的鉴别方法，以满足市场监管和质量控制的需要。

传统的铁皮石斛鉴别方法主要依据不同石斛的特征形状或性状对石斛的质量或真伪进行评价与鉴别[7-8]。然而石斛的外观极其相似，特别是相关近缘种很难鉴别；如果是加工品如铁皮枫斗，就更加难以区分。近些年来，DNA条形码被广泛应用到中药材鉴定中。如方强强等[9]利用ITS2片段对岩陀属进行PCR扩增和物种鉴定研究。石达理等[10]则通过DNA条形码对多种龙胆属植物和药材进行鉴定。叶子等[11]利用ITS序列对石斛类药材开展了鉴别研究。而基于DNA条形码的鉴别方法存在以下缺陷：首先，DNA条形码技术的种间分辨尚可，但存在种内分辨率低的问题，即可以区分铁皮石斛与其他石斛，但对于同是铁皮石斛的不同品系的鉴别存在不足[12-13]；其次，基于DNA条形码的鉴别方法，需要测序分析，检测过程繁杂，不利于快速检测方法的建立。

本研究拟分析铁皮石斛与其他石斛中ITS2的序列信息，评价ITS2的区分能力，并寻找铁皮石斛ITS2中特异的SNP位点，基于SNP位点建立铁皮石斛的快速鉴别方法，探索铁皮石斛鉴别方法的新途径。

1 材料与方法

1.1 材料

采集浙江不同地区具有代表性的铁皮石斛12种，以及来自广西和云南的其他石斛10种，所有样品均来自当地生产基地，样品具体信息见表1。

1.2 实验方法

1.2.1 DNA 提取

用75%乙醇擦拭所得石斛茎和嫩叶表面，称取100 mg石斛样品经液氮研磨，采用杭州新景生物公司植物总DNA提取试剂盒提取总DNA，用TE溶解DNA，使用Nanodrop核酸蛋白分析仪测定所提DNA浓度与D260/D280，并通过凝胶电泳判断DNA的质量和完整性，保存于-20 ℃待用。

1.2.2 PCR扩增及产物测序

查阅文献并结合前期实验选取DNA条形码ITS2引物[14](表2)，对全部实验材料进行PCR 扩增。采用25 μL PCR扩增体系，包括12.5 μL prime STAR@HS Premix(TaKaRa)、上下游引物各1 μL、2 μL DNA 模板、8.5 μL蒸馏水。反应程序为：98 ℃预变性1 min；98 ℃ 变性 10 s， 45 ℃退火5 s，72 ℃延伸30 s，共 35个循环；最后72 ℃延伸5 min。PCR扩增产物用琼脂糖凝胶进行电泳检测后，经胶回收送生工生物工程(上海)股份公司进行双向测序。

1.2.3 生物信息学分析

对于测序成功获得的序列，采用NCBI (National Center for Biotechnology Information)平台的BLAST工具与数据库进行比对。利用MEGA6.0(Molecular Evolutionary Genetics Analysis)软件进行序列比对，采用ClustalW算法，将测序两端无用序列删除。种内遗传距离的计算和系统发育邻接树(Neighbor joining)的构建利用的是 K2P(Kimura 2-parameter)模型，Bootstrap 的次数设为 1 000次，并自动删除小于50%的数值。

1.2.4 SNP位点特异性PCR验证

根据序列比对得到的SNP位点，利用Primer5.0软件设计位点特异性引物(表2)。对所设计的引物扩增条件优化，采用温度梯度的方式进行Tm值确定。选取特异性强、灵敏度高的引物组进行PCR验证，扩增产物进行凝胶电泳成像。

表1 材料信息

表2 引物信息

1.2.5 HRM分析

基于ITS2序列分析与PCR验证结果，分别设计大小为180 bp和53 bp各2对铁皮石斛HRM引物。首先进行PCR扩增，实验所配制的反应体系为Prime STAR®HS(Premix)(TaKaRa公司) 12.5 μL，上下游引物各1 μL(10 mmol·L-1)，DNA模板2 μL，ddH2O补足至25 μL。然后用 PCR 仪进行扩增，扩增程序为：98 ℃ 1 min；98 ℃ 15 s，退火15 s，72 ℃ 2 min，34 次循环；72 ℃ 2 min。HRM 程序温度设为55～95 ℃，温度增量为每2 s变化0.1 ℃。数据结果通过LightScanner96 软件分析。

2 结果与分析

2.1 ITS2扩增与序列分析

所选ITS2引物在22个石斛材料中均能扩增，而且扩增条带单一、明亮(图1)。直接进行胶回收纯化并测序，测序结果显示，所有扩增产物的测序结果理想，未出现重叠峰、杂峰和无信号等现象，测序成功率为100%。测序所得不同石斛材料中的ITS2序列长度范围为483～490 bp，经MEGA6.0软件对比后将低质量区和引物部分删除，保留472 bp的DNA序列作分析数据。利用NCBI-BLAST比较，石斛序列均与信息库的序列同源。经分析所测石斛属ITS2序列碱基组成平均含量为A=21.9%，T=22.7%，G=29.7%，C=25.7%，全序列CG含量分布范围在55.2%～57.9%。该序列中有保守位点342个，占72.4%；变异位点117个，占24.8%；简约信息位点51个。从数量上分析，变异位点约占1/4，变异程度较高，同时该序列具有一定程度保守性。基于ITS2序列构建NJ树(图2)，01～12号铁皮石斛聚为一支，其中鼓槌石斛与铁皮石斛的亲缘关系较近，大包鞘石斛、肿节石斛、喇叭唇石斛与铁皮石斛的亲缘关系较远。金钗和重唇石斛聚为一个分支，铜皮、束花和兜唇石斛聚为一个分支，其余石斛各自形成独立支系，无交叉聚类现象。从聚类结果来看，ITS2可以将铁皮石斛和其他石斛加以聚类和区分，与先前的研究结果一致[14]，因此可以利用ITS2来区分铁皮石斛与其他石斛。

M，1 000 bp Marker；1～12 ，铁皮石斛；13，金钗石斛；14，重唇石斛；15，钩状石斛；16，铜皮石斛；17，大包鞘石斛；18，束花石斛；19，兜唇石斛；20，喇叭唇石斛；21，肿节石斛；22，鼓槌石斛。下同。M， 1 000 bp Marker; 1-12， D. officinale; 13， D. nobile; 14， D. hercoglossum; 15， D. aduncum; 16， D. moniliforme; 17， D. wardianum; 18， D. chrysanthum; 19， D. aphyllum; 20， D. lituiflorum; 21， D. pendulum; 22， D. chrysotoxum. The same as below.图1 二十二种石斛ITS2序列电泳图Fig.1 The electrophoresis diagram of 22 ITS2 sequences

位于进化树分支上的数字表示该分支的支持率；若支持率>50，则说明该分支独立为不同种。The number on the branch of the evolutionary tree indicated the support rate of the branch; if the support rate was more than 50， it indicated that the branch was independent of different species.图2 基于ITS2序列构建的NJ树Fig.2 NJ tree constructed based on ITS2 sequence

对所有序列进行比对发现，12种浙江铁皮石斛472 bp的全长序列中，有6个铁皮石斛样品(2、3、5、6、9和10)在第317位碱基上有单碱基位点变异现象，由G突变为C，另外6个铁皮石斛和其余石斛在该位点上均为G，同时其他石斛材料在不同位点有不同的变异(图3)，分析结果表明，ITS2序列存在种内变异少、种间变异大的情况。ITS2在铁皮石斛种内高度保守性情况下少量位点的突变，为铁皮石斛种内区分提供了特异性SNP位点。

2.2 SNP位点PCR验证

图3 ITS2序列与及SNP位置Fig.3 ITS2 sequence and SNP position

进一步使用突变扩增体系(amplification refractory mutation system，ARMS)验证序列比对获得的SNP位点，将候补SNP位点设计在引物3′端，在距离3′端2个碱基位置设置突变位点C>A，使含变异位点C样品特异性扩增。扩增结果如图4所示，其中样品2、3、5、6、9和10中扩增出条带，扩增产物为128 bp，其余样品未能有条带扩增出，扩增结果与测序比对结果一致，进一步说明ITS2序列在此位置确实有G>C的突变。

2.3 基于HRM的SNP快速分型

ARMS方法虽然可以对突变位点进行检测，但检测结果需要电泳分析，过程繁杂，时间长，不利于大量样品的检测分析。基于此，我们建立了HRM对SNP的快速分型方法，HRM根据DNA序列的长度，GC含量和碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，通过引物/模板双链体的解链温度(Tm)值差异和极高的温度分辨率使分辨精度达到单个碱基差异的区分。在本研究中，由于12个铁皮石斛的ITS2序列中只有一个SNP位点，因此我们扩增了2个不同长度区域(53和180 bp)，SNP位于它们中间，从普通PCR结果来看，在12个铁皮石斛材料中2个片段都能扩增出来，然而长片段(180 bp)的HRM熔解曲线差异性不明显，分辨率低；而短片段(53 bp)的HRM熔解曲线差异明显，可很好地区分突变和未突变的样品(图5)。

M，1 000 bp Marker；1～12，浙江铁皮石斛；NC，阴性对照。M， 1 000 bp Marker ; 1-12， D. officinale from Zhejiang; NC， Negative control.图4 位点特异性PCR扩增电泳图Fig.4 Electrophoresis map of site-specific PCR amplification

A，引物HRM180的电泳图与高频率熔解峰图；B，引物HRM53的电泳图与高频率熔解峰图；M，500 bp Marker；01～12，浙江铁皮石斛。A， The upper part was the electrophoresis graph with the primer HRM180， and the lower part was the high-frequency melting peak graph; B， The upper part was the electrophoresis graph with the primer of HRM53， and the lower part was the high-frequency melting peak graph; M， 500 bp Marker; 01-12， D. officinale from Zhejiang.图5 ITS位点G>C的熔解曲线与电泳图Fig.5 Melting curve and electrophoresis diagram of ITS site G>C

3 讨论

目前基于DNA分子的铁皮石斛鉴定方法主要有DNA分子标记技术(RFLP、RAPD、SSR等)、DNA条形码技术，以及重测序技术等[15]。这些方法都要求高质量的DNA，而铁皮石斛组织中含有大量多糖、多酚类等物质，不易于DNA分离和提取，因此，本研究中的材料均为新鲜组织。有研究表明，3%的CTAB法可以提高DNA的提取质量[16]，然而对于铁皮石斛特别是其加工品的DNA的提取还需要进一步的研究。目前主要植物DNA条形码有：叶绿体accD、rpoC1、rpoB、ycf5、rbcL、matK、psbA-trnH、psbK-psbI、atpF-atpH和核ITS、ITS2等序列，不同的DNA条形码对不同材料的鉴别能力也不一样，包括其扩增性和分类能力。国际生命条形码联盟植物工作组推荐rbcl+matK组合作为陆生植物的DNA条形码。中国植物条形码研究团队发现核糖体核DNA条形码ITS与质体DNA条形码组合，可以显著提高rbcl+matK组合的分辨率。本研究初步探索了ITS2条形码对铁皮石斛及其他石斛的鉴别能力，发现ITS2条形码在铁皮石斛种内高度的保守性，同时含有少量的SNP位点，从而为铁皮石斛的种内鉴定提供了新的思路，ITS2序列片段位于核糖体DNA变异较大的基因转录间隔区，同时具有较高的拷贝数与较快的进化速率，适合作为DNA条形码。本研究根据ITS2序列中的一个SNP位点，将12种浙江铁皮石斛分为2类；若结合其他DNA条形码的利用，鉴定更多DNA条形码SNP，可以对不同的铁皮石斛进行更精细的区分与鉴定。而基于SNP的鉴别，有利于后期快速鉴别方法的建立。如本研究建立的基于HRM对SNP的快速分型方法可以快速高通量的完成SNP的鉴别。在建立HRM方法过程中，我们发现针对SNP特别是单一SNP的分型，短片段熔解曲线的分辨率要优于长片段，这可能由于如果扩增片段过长，单一SNP位点的差异，不足以引起整个长扩增序列Tm值的差异，而在短片段扩增区域中可以体现出Tm值的差异，从而更好地区分。因此，在建立基于HRM的SNP分型方法中，尽量选择短片段区域扩增。本研究针对铁皮石斛中ITS2条形码及其SNP位点的分析，揭示了植物条形码中蕴藏着少量特异性的SNP位点，结合SNP快速鉴别方法，有望为铁皮石斛的快速精准鉴定提供新的思路和方法。