秦建兵，李 雯，衣 昕，田美玲，何 辉，金国华*

(南通大学医学院人体解剖学系，南通 226001)

细胞周期是指细胞从一次细胞分裂形成子细胞开始到下一次形成子细胞为止，在此过程中，细胞的遗传物质复制并均匀地分配到两个子细胞。通过流式细胞术检测细胞内DNA 含量来进行细胞周期的分析在细胞生物学以及肿瘤生物学领域已愈来愈普遍。虽然此方法比较简单，但是因为操作者的熟练程度以及不同的实验方法，导致实验结果的重复性及数据的可信度下降。本文针对这一问题展开研究，探讨不同实验条件对流式细胞术细胞周期结果的影响。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器 大鼠C6 脑胶质细胞株(吉凯基因)、DMEM/F12 培养基(Corning)、胎牛血清、胰酶(Gibco)、碘化丙啶(propidium iodide,PI)/核糖核酸酶(ribonuclense,RNase)染色液(BD)、20×磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline,PBS)(上海生工生物)、流式细胞仪(BD FACS Calibur)。

1.2 影响因素及实验分组

1.2.1 乙醇浓度对细胞周期的影响 大鼠C6 细胞株贴壁培养至75 cm2细胞培养瓶底面积80%左右，胰酶消化，1 000 r/min 离心5 min，0.01 mol/L PBS洗2 遍，细胞计数后按1×106/管将细胞分配到若干离心管中。按照乙醇浓度分为低(50%)、中(75%)、高(100%)组。置于-20 ℃固定24 h 后检测。

1.2.2 固定方式对细胞周期的影响 按照固定方式分为细胞沉淀滴入预冷75%乙醇组、预冷75%乙醇滴入细胞沉淀组、1 mL PBS 重悬细胞后滴入3 mL预冷无水乙醇组、3 mL 预冷无水乙醇滴入1 mL PBS 重悬细胞组。置于-20 ℃固定24 h 后检测。

1.2.3 染色时间对细胞周期的影响 用1 mL PBS重悬细胞后滴入3 mL 预冷无水乙醇，-20 ℃固定24 h，按染色时间分为5 min、15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、7 d 组。

1.2.4 固定时间对细胞周期的影响 用1 mL PBS重悬细胞后滴入3 mL 预冷无水乙醇，按照乙醇固定时间分为2 h、1 d、7 d、28 d 组，分别放置-20 ℃保存后检测。……