刘素丽 朱 云 武会娟

(1. 北京实验动物研究中心有限公司，北京 102609)(2. 国家儿童医学中心 首都医科大学附属北京儿童医院 感染与病毒研究室，北京 100045)

虽然利用小鼠胚胎干细胞技术进行基因修饰的原理至今仍然适用，但CRISPR/Cas9技术的出现或者技术使得在小、大鼠和其它物种中构建基因工程模式生物更加容易[1-2]。Cas9核酸酶在sgRNA的引导下，在特定基因组位点产生DNA双链断裂(double-strand breaks，DSBs)，随后DSBs通过易错的非同源末端连接(Non-Homologous End-Joining，NHEJ)和高保真同源介导修复(homology-directed repair，HDR)机制进行修复。NHEJ可导致插入或缺失(insertions or deletions，InDels)，利用此修复方式可以通过一个sgRNA在靶基因编码区引入移码突变或通过两个sgRNA删除关键外显子或转录调控元件，从而构建基因敲除(Knock-Out，KO)小鼠模型；HDR是当供体模板存在时，能够产生精确的基因修饰，因此被用来构建敲入(Knock-In，KI)小鼠模型，但是效率较KO低。根据文献得知，KI中引入的模板序列可以是单链寡聚核苷酸(single-stranded DNA oligonucleotides，ssODN)[3-4]，也可以是带有长同源臂的双链DNA(double-strand DNA，dsDNA)[5-6]。ssODN适用于向靶位点引入短片段如小的融合标签(HA、Flag、V5)或点突变，而dsDNA则主要用于引入长片段如大的标签或荧光标记(GST、GFP、mCherry)。但dsDNA作为修复模板容易发生随机整合(尤其是线性dsDNA)，并且其会对细胞产生毒性。Ghanta等[7]研究得到，相较于dsDNA，ssODN具有更高的修复效率。

点突变小鼠是转录因子结合、磷酸化位点功能分析和单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)作用检测的重要体内研究工具。通过将Cas9 mRNA/sgRNA和ssODN共同注入小鼠受精卵可高效制备点突变小鼠。本文将重点概述利用CRISPR/Cas9系统和ssODN供体构建点突变小鼠的方法，例如sgRNA和ssODN的设计及体外转录、受精卵显微注射、子代鼠基因型鉴定等。……