孝飞飞 孙洪光 李建厂 朱淑霞 田春梅

多药耐药是化疗失败的最主要原因之一。凋亡抑制蛋白和多药耐药膜转运蛋白P-gp 过度表达是多药耐药的两个主要原因［1］,Apollon 是凋亡抑制蛋白家族主要成员,尤其在复发白血病、诱导无缓解、髓外白血病患者中高表达［2］。本实验通过siRNA 技术沉默562/DNR 细胞中Apollon 基因表达,观察P-gp 表达水平,检测K562/DNR 对化疗药物敏感性的变化。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 将细胞分为实验组(脂质体转染靶向Apollon 的siRNA K562/DNR)、细胞对照组(K562/DNR)和阴性对照组(脂质体转染的siRNAnc)。K562/DNR 细胞株由滨州医学院中心实验室培养；脂质体LipofectamineTM2000 购于美国Invitrogen 公司；兔抗人Apollon 多克隆抗体一抗购于美国Santa Cruz 公司,带有红色荧光标记的四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)二抗购于上海江莱生物科技有限公司；四甲基偶氮唑盐购于美国Sigma 公司；Apollon 及β-actin 引物由上海赛百盛公司合成；靶向Apollon 的siRNA 序列、阴性对照siRNA 序列由上海吉玛公司合成。

1.2 RT-PCR 法 检测ApollonmRNA的表达水平实验组、阴性对照组采用前期稳定转染的细胞接种于6孔板,每组2孔,于24h后提取总RNA,两步法行RT-PCR。Apollon引物序列：Sense 5'-TGGCTCAAGCTGGATTTTAT-3',Anti-sense 5'-TTCAGACCAAGGTTCATCAG-3',扩增长度116bp。内参照β-actin 序 列：Sense 5'-TCATGTTTGAGACCTTCAA-3',Anti-sense 5'-GTCTTTGCGGATGTCCACG-3',扩增片段513 bp。PCR 产物经含EB 的10 g/L 琼脂糖凝胶上电泳,采集、分析图像,计算出目的基因mRNA 的相对表达水平：以Apollon/β-actin 灰度比值(ODR)表示。

1.3 Western Blot 检测P-gp 的表达 收集转染5 d 后细胞,依次加入bufferA、B、C,裂解细胞,离心后收集上清,取等量蛋白,进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后将蛋白转移到PVDF 膜上,5%脱脂奶粉的TBST 封闭液封闭2 h,经1×TBST 充分漂洗(10 min×3 次),加兔抗人MDR-1 多克隆抗体(稀释度为1∶300),4℃孵育12 h,充分漂洗后加山羊抗兔二抗(稀释度为1∶2400),室温孵育1 h,充分漂洗,化学发光法显色。……