高永伟，李志中，王建国，丛晓楠，宋艳萍，张秀玲

(1.威海市环翠区动物疫病预防控制中心，山东 威海 264200；2.山东新希望六和集团有限公司，山东 青岛 266000；3.威海市环翠区畜牧业发展中心，山东 威海 264200)

0 引言

环翠区某规模蛋鸡场，其中一栋鸡舍自开产以后出现产蛋率上升缓慢，产蛋率低，160日龄产蛋率仅为73%，蛋品质量差，陆续出现白壳蛋、软壳蛋，鸡群体重不达标，平均低于标准5%～10%，同时伴有呼吸道异常症状；鸡只剖解见肝脏淤血，肝脏边缘有出血点，腺胃有出血，肌胃下有溃疡，脾脏变小，盲肠扁桃体有出血等情况。

由于临床诊断不足以对该鸡群进行确诊，特对发病鸡群进行2次采样，通过实验室病原学及血清学检测分析，确诊该鸡群为免疫抑制病与支原体混合感染，现将检测诊断报道如下。

1 材料与方法

1.1 样品采集

分别取160日龄及175日龄患病蛋鸡肛门拭子10份、咽喉拭子10份、病变部位组织5份、血清30份。

1.2 主要试剂

ALV-J抗体、REV抗体、CAV抗体、MG抗体、MS抗体、IB抗体ELISA检测试剂盒，购自北京爱德仕公司；病毒核酸提取试剂盒Easy Pure Viral DNA/RNA Kit购自北京全式金生物技术有限公司。H9/ND/RE-11/RE-12检测抗原购自哈尔滨维科生物技术开发公司。

ALV-J引物，MDV引物，CAV引物，REV引物，M引物，MS引物，MG引物，IB引物，FADV引物及REO检测引物为本实验室设计及保存。

1.3 仪器设备

PCR仪，德国Biometra公司;酶标仪，美国伯腾公司；凝胶成像仪，购自美国伯乐公司。

2 实验方法

2.1 PCR病原检测

2.1.1 样品处理

病料：将采集的10份的病料按1:4加入灭菌的PBS或生理盐水，置研磨器(灭菌)中充分研磨后，按每管1mL分装到1.5 mL灭菌的离心管中，反复冻融3次，10 000 r/m离心5 min，取上清液200 μL用于核酸提取。

棉拭子：将采集的20份咽喉拭子及20份肛门拭子进行5合1处理，加入灭菌的PBS或生理盐水于震荡仪中震荡20 min后，10 000 r/m离心5 min，取上清液200 μL用于核酸提取。

2.1.2 病毒RNA的提取及RT-PCR扩增

分别取处理后的病料及拭子上清、阳性对照和阴性对照各200 μL，按照金瑞鸿捷病毒核酸提取试剂盒说明书进行核酸的提取。

使用一步法RT-PCR试剂盒，按照如下20 μL体系配制进行PCR扩增：20 μmol/L上下游引物(M/ND/IB)各0.4 μL，2×One-Step Reaction Mix 10 μL，Enzyme Mix 0.4 μL，灭菌的蒸馏水3.03 μL，RNA模板5.5 μL。PCR扩增程序为：45℃ 25 min；94℃预变性5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 35 s，共进行32个循环；最后72℃延伸8 min。

2.1.3 病毒DNA的提取及PCR扩增

分别取病料及拭子上清、阳性对照和阴性对照各200 μL，按照金瑞鸿捷病毒核酸提取试剂盒说明书进行核酸的提取，按照25 μL体系配制进行PCR扩增：20 μmol/L上下游引物(MG/MS/FADV/ALV-J/REV/CAV)各1μL，2×EasyTaq PCR SuperMix 12.5 μL，灭菌的蒸馏水8.5 μL，DNA模板2μL。PCR扩增程序为：95℃预变性5 min；94℃ 45 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，共进行35个循环；最后72℃延伸7 min。

2.1.4 PCR扩增结果观察与判定

取PCR产物5 μl，进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，结束后用紫外凝胶成像仪观察结果。

2.2 ELISA检测

将2个日龄共计60份血清，用样品稀释液进行1：500稀释，参考爱德仕ALV-J抗体、IB抗体、MG抗体、MS抗体、REV抗体及CAV抗体检测试剂盒说明书，依次进行加样、孵化、加酶标抗体、孵化、显色及终止等一系列操作。最后将板放入酶标仪，在IDEXX软件中，查找个相应抗体的程序(650 nm)，测量吸光值A(OD650值)。根据OD值参考说明书来判定结果，并统计各项阳性率。

2.3 HI检测

将2个日龄共计60份血清，参考中国兽药典第三版附录方法，依次进行各项抗原HA测定、4单位配制及H9、ND、RE-11、RE-12的HI抗体检测，根据结果统计抗体平均值及离散度。

3 检测结果

3.1 PCR检测结果

PCR电泳结果显示，肛门拭子的REV与MG出现目的条带，大小分别为340 bp和500 bp，其他样品的目的条带均未出现，如图1所示。

3.2 ELISA检测结果

对160日龄及175日龄采集的60份血清进行ELISA抗体检测，各个项目均呈现不同程度的阳性，具体结果，如表1所示。

表1 ELISA检测结果

图1 PCR检测结果

3.3 HI检测结果

对160日龄及175日龄采集的60份血清进行HI抗体检测，各个项目均为阳性，且变异系数均低于8%，具体结果，如表2所示。

表2 HI检测结果

4 诊断结果

通过实验室病原学及血清学检测，并结合临床症状及剖解变化，可以诊断为本批鸡群存在CAV、ALV-J及REV 3种免疫抑制病与MG、MS混合感染，且感染时间段不同，前期感染CAV和MS，而当前处于感染期的疫病为ALV-J、REV与MG。

5 讨论

CAV、REV、ALV-J是危害养鸡业最常见的免疫抑制性病毒。它们先后或共同感染时使鸡对疫病的易感性提高，或相互作用，使各自的致病力增强。3种免疫抑制病既可以垂直传播也可水平传播，对混合感染鸡群分析发现，鸡群均普遍存在生长阻滞、生产性能下降、多种病原感染、总的发病率和死淘率增加等现象，这可能是机体免疫抑制所造成的后果[1，2]。MS、MG为生产中常见的支原体病，MS在临床表现关节炎、胸囊肿，同时也会引起鸡群的呼吸道异常症状，而MG基本表现为气囊炎及呼吸道症状。当机体抵抗力下降时，二者发病表现尤为严重，且难以治愈[3，4]。

通过本病例的检测诊断发现，它既能够体现出是否存在多种疫病的感染，也能体现出疫病感染的状态。本鸡群由于发病时间较长，且严重影响了生产，通过临床症状不能完全找到病因，需要结合实验室检测来进行诊断。经过病原学及血清学检测发现，一是该产蛋鸡群较早感染了CAV与MS，整体鸡群抗体的阳性率为100%；二是鸡群正处于REV、ALV-J及MG等疫病感染期内，且感染率呈上升趋势。而鸡群的传支、流感及新城疫抗体具有良好的水平，并未发现因鸡群感染免疫抑制病后对鸡群的影响[5]。

从该鸡群的后期防控来看，可以通过使用提高机体抵抗力的中药来降低免疫抑制病对鸡群的危害，同时加强饲养管理、进行带鸡消毒，减少环境中的病毒细菌载量，降低机体呼吸系统中病原的载量，最终降低在活跃期的MG及REV等对生产的影响[6]。

实验室检测已经对动物疫病诊断发挥了重要作用，同时也起到了预警作用，进一步建立并完善动物疫病防控体系，将为畜禽生产带来更大价值。