申 翔,杨 蔚,李代清

(1天津市人民医院重症医学科,天津 300000;2天津医科大学朱宪彝纪念医院糖尿病研究室;3常德市第一人民医院内分泌科;*通讯作者,E-mail:daiqingli68@126.com)

2型糖尿病发病率在世界范围内呈“爆发式”增长的趋势,目前对胰岛beta细胞分泌缺陷分子靶点的研究是热点之一,其中针对胰岛素颗粒酸化、锚定、启动、融合等过程的研究还有待深入。国外文献[1]报道和我们前期研究结果[2]表明多重耐药基因Mdr1(abcb1)调控的P糖蛋白可能是参与胰岛素颗粒酸化和释放的重要分子之一,但国内该领域的研究资料却十分有限,本研究通过分析大鼠胰岛beta细胞截短型P糖蛋白的表达,为进一步探讨P糖蛋白表达对胰岛素分泌的影响提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康雄性Wistar大鼠,250-300 g,10只,由天津医科大学实验动物中心提供。

1.2 细胞与试剂

大鼠胰岛beta细胞瘤细胞系(INS-1细胞),由武汉大学细胞库提供;TrizolReagent(Invitrogen, USA),DEPC(Sigma, USA),反义核酸第一链cDNA合成试剂盒(Thermo, USA),TaKaRa LA Tag(TaKaRa, Japan),琼脂糖凝胶DNA/PCR产物回收试剂盒(BIOMIGA, USA),质粒小量提取试剂盒(BIOMIGA,USA),SYBR premix Ex TagTM(TaKaRa,Japan),罗氏地高辛标记与检测试剂盒(Roche,Switzerland),蛋白提取试剂盒(上海贝博)。

1.3 实验方法

1.3.1 基因abcb1b、abcb1a的检测 实时荧光定量PCR方法检测大鼠胰岛、INS-1细胞及肝P糖蛋白主要调控基因abcb1b、abcb1a的表达,用Trizol法分别提取大鼠胰岛、INS-1细胞、肝脏的总RNA,针对abcb1b的3′末端及5′末端设计N端引物和C端引物,并设计P糖蛋白的另一个调控基因abcb1a的引物,反应引物均出自文献[3]并经BLAST软件行同源性分析,由北京奥科生物公司合成。BioPhotometer分光光度计测定总RNA的纯度,OD260/280为1.8-2.0,电泳法测定完整性。以各RNA标本经逆转录形成的cDNA为模板进行PCR扩增,反应条件为94 ℃预变性10 min后经95 ℃变性5 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共40个循环。……