陈晓倩，刘永宏，黄炳耀

(广西中医药大学海洋药物研究院，广西南宁 530200)

0 引言

藻红蛋白是一种具有高度荧光特性和光稳定性的藻胆蛋白，是极好的天然色素和荧光剂，可以广泛应用在医疗卫生、食品、化妆品以及染料等行业[1-4]。此外，藻红蛋白还可以作为优良的蛋白质来源，添加在食品、药品以及动物饲料中[1,3]。在大多数红藻中，藻红蛋白可占藻胆蛋白的70%以上[5]，其中以紫球藻(Porphyridiumcruentum)的含量最高，因此紫球藻是生产藻红蛋白的优质材料。在紫球藻的类囊体膜上，藻红蛋白与其他3种藻胆蛋白聚合形成高度有序的超分子复合体，即藻胆体(Polyunsaturated Fatty Acids,PBSs)[6-9]。在自然状态下，PBSs结构完整，并与类囊体膜结合紧密，这时紫球藻呈现紫红色[10-12]。当受到外界胁迫时，作为储藏蛋白的藻红蛋白与连接器多肽分离并从PBSs上降解下来[6]，用作氮源以供藻类生存。在此过程中，紫球藻开始褪色，严重时细胞呈现黄绿色。因此，普遍认为生长环境因素会影响紫球藻藻红蛋白的积累。有研究发现，氮盐含量对藻红蛋白的积累有显著的影响，高氮对其有抑制作用[13，14]；另外，低光条件下的细胞需要更多的藻胆蛋白用来吸收更多的光能，因此低光能刺激藻胆蛋白的合成与积累[15，16]。

目前，实验室多采用摇瓶、充气等方式进行紫球藻的培养，但这些常用培养方式均存在平行性差、可控性不佳的缺点。小型普通机械搅拌式光照发酵罐是实验室常见发酵装置，可控性好、技术条件成熟，仅需对光源进行调整就可用来培养光合微生物，大大增加了设备的利用率。为避免实验室内培养紫球藻的一系列不良因素影响，本研究选用容量为10 L的小型机械搅拌式光照发酵罐作为培养紫球藻的光生物反应器，采用单因素法(分别以搅拌速率、光照强度、氮浓度、NaCl浓度作为单一变量因子)[17，18]，对紫球藻发酵生产藻红蛋白的条件进行优化，确定最佳生产条件，为紫球藻藻红蛋白的工业化生产提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料

紫球藻藻种由山东大学(威海)提供，由本实验室进行扩大培养。

微量元素营养液的配制参考文献[18-20]，具体配方为2 mmol/L FeCl3·6H2O，7 mmol/L MnCl2，1 mmol/L ZnCl2，1 mmol/L CoCl2·6H2O，1 mmol/L CuSO4·5H2O，1 mmol/L (NH4)6Mo7O2，2 mmol/L EDTA-2Na。

人工海水培养基(Artificial Seawater,ASW) 的配制参考文献[18-20]，具体配方为0.74 g/L CaSO4，0.8 g/L KCl，2.6 g/L MgCl2·6H2O，1.9 g/L MgSO4，1 mL f/2维生素母液，1 mL微量元素营养液。

f/2维生素母液参考市面所售品牌MwVin的维生素溶液配方，具体配方为0.5 mg/L 维生素B12，100 mg/L盐酸硫胺素，0.5 mg/L生物素。

1.2 方法

1.2.1 紫球藻培养

共设置4组实验，每组实验均以ASW作为基础培养基，NaNO3作为氮源，用NaCl调整培养基盐度。各组的培养温度均为25℃，通气量为120 L/h。

搅拌速率组：本组培养基的氮浓度均为5 mmol/L，NaCl浓度为30‰，光照强度为5 000 Lx，以搅拌速率为可变条件设置5个实验小组，搅拌速率分别为50，100，150，200，250 r/min。

光照强度组：本组培养基的氮浓度均为5 mmol/L，NaCl浓度为30‰，搅拌速率为200 r/min，以光照强度为可变条件设置5个实验小组，光照强度分别为2 000，4 000，5 000，6 000，8 000 Lx。

氮浓度组：本组培养基的NaCl浓度均为30‰，光照强度为5 000 Lx，搅拌速率为200 r/min，以氮浓度为可变条件设置5个实验小组，氮浓度分别为2，4，6，8，10 mmol/L。

NaCl浓度组：本组培养基的氮浓度均为5 mmol/L，光照强度为5 000 Lx，搅拌速率为200 r/min，以NaCl浓度为可变条件设置5个实验小组，NaCl浓度分别为10‰、20‰、30‰、40‰、50‰。

1.2.2 藻红蛋白相对含量的测定方法

迄今为止，已经从紫球藻中分离纯化出两种藻红蛋白，B-藻红蛋白和b-藻红蛋白，其中以B-藻红蛋白含量最多且最为稳定[19]。B-藻红蛋白和b-藻红蛋白均在545 nm处有一主要吸收峰[21]，所以一般以藻体蛋白粗提液在545 nm处的吸光度代表藻红蛋白的相对含量。

测定方法参考文献[18]。每天固定时间取样一次，每次取不同实验组的藻液5 mL作为测试样品。样品于5 000 r/min条件下离心5 min，除去上清，藻细胞沉淀使用3 mL 0.01 mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH值为7.0)进行悬浮。然后使用超声波细胞粉碎机进行藻细胞破碎，超声功率50 W，工作时间7 s，间歇时间5 s，循环30次。破碎完毕后，对样品进行离心(5 000 r/min，10 min)，所得上清液即为藻红蛋白测试液。然后使用分光光度计测其在545 nm处的吸光度，最后以每107个细胞所对应的吸光度作为藻红蛋白相对含量的评定标准。

2 结果与分析

2.1 搅拌速率对紫球藻藻红蛋白含量的影响

紫球藻可产生大量胞外多糖，具有一定的黏性，当搅拌速率过低时会导致藻体沉积，而速率过高时会对藻体造成机械损伤[22]，所以搅拌速率过低和过高均会影响紫球藻生长和藻红蛋白的积累(图1)。在培养期内，比较各组藻红蛋白的产量，大致呈现150 r/min组>100 r/min组>200 r/min组>50 r/min组>250 r/min组的趋势；在培养的4—7 d内，各组藻红蛋白的合成速率最快。在收获时(第9天)，150 r/min组的藻红蛋白产量最高。另外，当设置搅拌速率为50 r/min时，前期培养过程中藻体易沉积，生长速度缓慢，氮源消耗也较缓慢，所以在后期其藻红蛋白产量较其他组有所上升；而搅拌速度过高时，藻红蛋白的积累会受到一定抑制。综上所述，在生产紫球藻藻红蛋白时，搅拌速率建议使用150 r/min。

图1 搅拌速率对紫球藻藻红蛋白含量的影响

2.2 光照强度对紫球藻藻红蛋白含量的影响

由图2可知，紫球藻藻红蛋白的含量与光照强度呈反比。光照较弱时，紫球藻藻红蛋白的产量较高；光照较强时，其积累量却会相对降低。本实验中，各组藻红蛋白的积累量情况是2 000 Lx组>4 000 Lx组>5 000 Lx组>6 000 Lx组>8 000 Lx组，收获时，2 000 Lx组藻红蛋白产量最高。紫球藻为光合自养生物，藻红蛋白为其重要的捕光色素蛋白，当光照强度改变时，紫球藻自身会做出相应改变来适应环境变化。本研究中，当光照强度为2 000 Lx时，紫球藻藻红蛋白含量最高，此时藻体颜色最深；随着光强增加，藻红蛋白含量降低。卢晓等[23]、陈伟洲等[24]在研究红藻门的江蓠时也发现藻红蛋白随光强变化有相似的情况，这或许是因为低光下细胞需要更多的藻胆蛋白以便吸收更多的光能，所以更能刺激藻胆蛋白的合成与积累[14，15]。

图2 光照强度对紫球藻藻红蛋白含量的影响

2.3 氮浓度对紫球藻藻红蛋白含量的影响

由图3可知，各实验组藻红蛋白含量总体呈现8 mmol/L组>10 mmol/L组>6 mmol/L组>4 mmol/L组>2 mmol/L组的变化趋势，在收获时8 mmol/L组藻红蛋白产量最高。在培养过程中，低氮组(2，4 mmol/L组)的藻红蛋白产量先增加，后因为氮源的消耗其含量逐渐降低(藻液颜色变浅)；而6，8，10 mmol/L组藻红蛋白含量随培养时间逐渐升高(藻液颜色变深)。在一定氮浓度范围内(2—8 mmol/L)，藻红蛋白含量与氮浓度成正比，但过高氮浓度(10 mmol/L)并不能有效提高藻红蛋白含量，该结果与前人已公布的研究结果[13-16]基本一致。因此，在以NaNO3为氮源生产紫球藻藻红蛋白时，其氮浓度建议使用8 mmol/L。

图3 氮浓度对紫球藻藻红蛋白含量的影响

2.4 NaCl浓度对紫球藻藻红蛋白含量的影响

紫球藻对盐度适应性较强，淡水、海水中均能生长，但当前关于NaCl浓度对紫球藻藻红蛋白含量影响的研究较少。从本研究结果可以看出(图4)，在培养期内，各组藻红蛋白的产量从高到低依次为20‰组>10‰组>30‰组>40‰组>50‰组，收获时，20‰组藻红蛋白产量最高。这说明紫球藻生产藻红蛋白需要适宜的NaCl浓度，浓度过低或过高对其积累都有一定程度的抑制。因此，在生产紫球藻藻红蛋白时，NaCl浓度建议使用20‰。

图4 NaCl浓度对紫球藻藻红蛋白含量的影响

3 结论

本试验利用搅拌式光照发酵罐培养紫球藻生产藻红蛋白时发现，以搅拌速率、光照强度、氮浓度和NaCl浓度作为单一变量因子，藻红蛋白分别在150 r/min的搅拌速率、2 000 Lx的光照强度、8 mmol/L的氮浓度、20‰的NaCl浓度条件下积累量达到最高值。此外，从成本效益上看，上述发酵条件也是较优的选择:20‰的NaCl减少了原料的使用，150 r/min的搅拌速率和2 000 Lx的光照强度使发酵过程中的能源损耗较低。本研究为单因素实验分析，为得到更加合理的生产方案，还需在此基础上进一步使用多因素分析，确定最佳生产条件，为紫球藻藻红蛋白的开发利用奠定基础。