滕 蔓，迟佳琦，柴书军，罗 俊,4

(1.河南省农业科学院 农业部动物免疫学重点实验室/河南省动物免疫学重点实验室，河南 郑州 450002；2.河南省农业科学院 中英禽病国际研究中心，河南 郑州 450002；3.北京中医药大学 东方医院，北京 100078；4.河南科技大学 动物科技学院/动物疫病与公共卫生重点实验室，河南 洛阳 471003)

转化生长因子结合蛋白(Transforming growth factor binding proteins,TGFs)是一类细胞外基质蛋白超家族，具有调节细胞的增殖、分化、发育和凋亡,控制细胞生长速度,刺激细胞外基质形成，抑制免疫反应，增加黏附分子表达，影响胚胎发育和器官形成以及肿瘤发生等生物学功能[1-4]。潜在转化生长因子结合蛋白(Latent transforming growth factor-β binding proteins，LTBPs)是细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)糖蛋白超家族的成员，包括纤维蛋白1、2和3以及潜在的TGF结合蛋白1—4[5-7]。与纤维蛋白一样，LTBPs主要由6个半胱氨酸重复序列组成。其中，LTBPs 的1、3、4中的第3个半胱氨酸重复序列是潜在TGFs的共价结合位点[8-9]，在TGFs的储存、激活和调节中起重要作用[10]。

TGF-β信号通路及其相关蛋白是近年来信号传导研究领域的热点，LTBP1蛋白在调控TGF-β信号通路的信号传递中发挥重要作用。LTBP1蛋白的降解可激活TGF-β信号通路，继而导致肿瘤的发生和发展[11-13]。因此，开展相关研究常常需要用到LTBP1蛋白抗体。目前，可用的商品化LTBP1抗体均只能识别哺乳动物细胞蛋白，尚无可用于识别禽源LTBP1蛋白的抗体，严重制约了深入开展相关研究。鉴于此，制备抗鸡LTBP1蛋白的特异性单克隆抗体，旨在为后续禽类LTBP1蛋白相关的功能研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和材料

pET-30a载体为本实验室保存；E.coliJM109和BL21感受态细胞、pMDTM18-T载体、限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ、ExTaq酶、DNA Ligation Kit 2.0连接酶、IPTG和低分子质量DNA Marker均购自TaKaRa公司；PEG-1500、Plasmin(From bovine plasma)均购自德国Roche公司；RIPA裂解液和PierceTMBCA Protein Assay Kit均购自Thermo公司；ECL显影液购自CST公司；NS0 细胞、Hela、293T、BHK-21、L929、PK-15、ST、Vero、Cos-7、DF-1传代细胞系均为本实验室保存；FITC标记的兔抗鼠IgG购自美国Abbkine公司；RPMI-1640细胞培养基、HAT及HT筛选培养基、胎牛血清(FBS)均购自Gibco公司；其他常规试剂均为国产分析纯产品。

1.2 鸡LTBP1表达载体的构建

用Primer Premier 5.0设计扩增鸡LTBP1基因的特异性引物，上游引物序列:5′-GTTGGATCCTGCCACCTTCCCTGCATG-3′，下游引物序列:5′-GGTCTCGAGTTAGGCTTTTCCAACACTGCAA-CAG-3′(下划线标示BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点)，以CEF细胞cDNA为模版，PCR扩增鸡LTBP1部分基因片段(基因位点：229—1 153)。PCR反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR产物经1%琼脂糖电泳鉴定后，利用凝胶回收试剂盒进行常规割胶，回收纯化后的PCR产物与pMDTM18-T载体连接、转化并测序鉴定。将鉴定正确的pMDTM18-T-LTBP1克隆质粒和pET-30a表达载体同时用BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切，1%琼脂糖电泳回收LTBP1基因片段与表达载体质粒，按照说明书用DNA Ligation Kit 2.0连接酶连接，构建重组表达质粒pET-30a-LTBP1，转化E.coliBL21，涂板培养过夜，挑单菌落进行PCR鉴定，阳性菌进行扩大培养、质粒提取及双酶切鉴定。

1.3 鸡LTBP1重组蛋白的表达及纯化

将含pET-30a-LTBP1质粒的阳性菌种活化，接种于LB 培养基(含100 μg/mL 氨苄青霉素)，37 ℃、250 r/min 培养至OD600达到0.6～0.8 时，加入IPTG使终浓度为1 mmol/L，诱导培养3 h，取菌样1 mL离心收集菌体，加入适量PBS重悬后加等体积的2×SDS-PAGE电泳上样缓冲液混匀，沸水浴5 min裂解菌体，进行SDS-PAGE 电泳检测，用考马斯亮蓝染色，再用脱色液脱色至背景清晰，观察表达结果。将上述检测确定诱导表达的菌种在37 ℃条件下大量培养并按上述方法诱导表达，收集菌体用PBS重悬后，在冰浴条件下超声破碎，4 ℃条件下12 000 r/min 离心10 min，收集沉淀。用8 mol/L尿素溶解包涵体，随后用逐步递减浓度的尿素溶液连续透析，最后溶于10 mmol/L Tris溶液中。将上述蛋白质溶液加入镍柱中吸附，分别用Wash Buffer洗涤、Elution Buffer 洗脱，分别收集洗脱液，将各管洗脱液用紫外分光光度计分别测定蛋白质含量。分别取上述洗脱液与等量的2×SDS-PAGE电泳上样缓冲液混匀，煮沸变性 5 min，进行SDS-PAGE电泳检测纯化结果。

1.4 小鼠免疫

取6周龄Balb/C雌性小鼠5只，首免用纯化的LTBP1蛋白以50 μg/只的剂量加等量弗氏完全佐剂混合乳化，背部皮下分点注射。加强免疫时用弗氏不完全佐剂混合乳化，共免疫4次，每次间隔3周，4免后10 d断尾采血分离血清，间接酶联免疫吸附试验(Indirect enzyme-linked immunosorbent assay,iELISA)和间接免疫荧光试验(Indirect immunofluorescence assay,IFA)检测血清抗体效价。选择效价最高的小鼠用于细胞融合。融合前腹腔注射不加佐剂的LTBP1纯化蛋白，按50 μg/只的剂量进行超免，超免3 d后取小鼠脾脏细胞用于细胞融合。

1.5 细胞融合及阳性杂交瘤筛选

按常规方法进行细胞融合，将NS0 细胞与超免鼠脾脏细胞以个数比1∶10进行混合，PEG-1500为融合剂，融合后细胞用RPMI-1640/HAT培养液分散接种于4块96孔培养板中，200 μL/孔，置37 ℃、5% CO2培养箱中培养，第7～10 天抽取细胞上清检测。用纯化的LTBP1蛋白包被酶标板，iELISA法检测杂交瘤细胞上清，阳性杂交瘤细胞转至24孔板扩大培养，复测后选取强阳性孔2～3个以有限稀释法进行亚克隆，一般进行2～3次，末次亚克隆后选出状态良好、生长旺盛的强阳性单克隆细胞株扩大培养，离心收集细胞用冻存液(DMSO∶小牛血清∶DMEM=1∶5∶4)重悬细胞后冻存于液氮中。

1.6 单克隆抗体腹水制备

采用体内诱生腹水法生产单克隆抗体[14]。接种杂交瘤细胞之前14 d，挑选经产的Balb/C小鼠，腹腔注射灭菌液体石蜡，0.5 mL/只。将生长对数期单抗杂交瘤细胞经灭菌PBS洗2遍，重悬后腹腔接种已预处理的Balb/C小鼠(3×106个细胞/0.5 mL/鼠)，约7～14 d待小鼠腹部膨胀明显时收集腹水，3 000 r/min离心15 min后，收集上清，-20 ℃保存备用。

1.7 鸡源细胞与单克隆抗体的IFA染色鉴定

复苏液氮冻存的DF-1传代细胞系，同时按常规方法制备CEF，分别用含10% FBS的DMEM培养基，置37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h后，更换含2% FBS的DMEM维持液，37 ℃、5% CO2培养箱中培养3～4 d。取出细胞用PBS洗2遍，加入用无血清DMEM培养基稀释的0.1 U/mL的Plasmin溶液，37 ℃温箱孵育 1 h[13]，然后按常规方法进行IFA染色，对筛选的抗鸡LTBP1蛋白的单克隆抗体腹水进行鉴定。

1.8 Western blot鉴定

将DF-1和CEF细胞分别接种至6孔细胞板上，生长至细胞单层后弃去培养基，每孔用1 mL PBS洗2遍，然后每孔用1 mL PBS分别刮取收集细胞，3 000 r/min离心5 min，弃去上清，每种细胞各加入100 μL预冷的RPIA细胞裂解液，冰上静置10 min后将裂解液与细胞充分混匀。收集细胞裂解悬液，4 ℃条件下12 000 r/min离心10 min，沉淀用PBS洗2遍，加入用无血清DMEM培养基稀释的0.1 U/mL的Plasmin溶液，37 ℃温箱消化1 h，80%乙醇溶液沉淀，4 ℃条件下12 000 r/min离心10 min，沉淀用PBS溶解[15]。然后使用PierceTMBCA Protein Assay Kit，对上述方法提取的2种细胞间质蛋白的浓度进行测定，-80 ℃保存备用。定量后的DF-1和CEF细胞间质蛋白以相同的上样量进行 SDS-PAGE电泳，然后用半干转膜仪将凝胶电泳分离的蛋白转移到PVDF膜上(恒压15 V，转膜90 min)。转膜后，以5%脱脂奶室温封闭2 h，PBST洗涤3遍；用5%脱脂奶1∶1 000稀释的待检抗LTBP1单克隆抗体腹水孵育，置4 ℃摇床中孵育过夜，PBST振摇充分洗涤；加5%脱脂奶1∶1 000稀释的羊抗鼠 IgG-HRP，37 ℃孵育1 h，PBST洗涤3遍。用ddH2O稀释ECL反应液20×LumiGLOReagent和20×Peroxide至工作浓度，将反应液滴在膜上孵育1～5 min，弃ECL工作液，将膜转移至X片夹中压片。暗盒中曝光3～5 min后取出，依次置入显影液和定影液中。最后用水冲洗胶片并晾干。

1.9 哺乳动物细胞与单克隆抗体的IFA鉴定

从液氮中取出冻存的293T、Hela、Vero、Cos-7、BHK-21、L929、PK-15和ST传代细胞系，常规方法进行复苏，按照1.7中所述方法，利用IFA对待检抗LTBP1单克隆抗体腹水与这8种不同来源的细胞LTBP1蛋白反应的特异性进行分析。

2 结果与分析

2.1 鸡LTBP1蛋白表达载体的构建和鉴定

PCR扩增鸡LTBP1基因片段，1%琼脂糖电泳回收产物连接 pMDTM18-T载体，转 化大 肠 杆 菌JM109 感受态细胞中，经 PCR鉴定和测序分析，将构建正确的pMDTM18-T-LTBP1克隆质粒和pET-30a表达载体同时用BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切，1%琼脂糖电泳分别回收LTBP1基因片段和pET-30a载体片段，经T4连接酶连接后转化E.coliBL21感受态细胞，挑单菌落摇菌培养提取质粒后进行PCR鉴定以及BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定，均可见符合预期大小的电泳条带，确认LTBP1基因正确插入，成功构建重组表达质粒pET-30a-LTBP1(图1)。

M.DNA Marker；1.pET-30a-LTBP1的PCR产物；2.pET-30a-LTBP1的双酶切

2.2 鸡LTBP1蛋白的表达与纯化

收集pET-30a-LTBP1转化BL21阳性克隆的菌液，经IPTG诱导培养3 h后，SDS-PAGE电泳检测蛋白质表达情况。结果显示，与pET-30a空载质粒转化菌相比，经诱导表达后的pET-30a-LTBP1重组质粒阳性菌中有1条明显的约35 ku的蛋白质表达条带。诱导的菌体经离心和高压破碎离心后，发现LTBP1蛋白主要以包涵体形式存在于E.coliBL21中。将包涵体蛋白洗涤、溶解、复性、透析、镍柱纯化后将收集的洗脱液经SDS-PAGE电泳分析。结果显示，复性后有部分可溶性LTBP1蛋白存在，纯度较高(图2)。

M.蛋白质Marker；1.IPTG诱导菌液；2.未诱导菌液；3.诱导菌裂解液上清；4.诱导菌裂解液沉淀；5.1 mol/L尿素溶解上清；6.1 mol/L尿素溶解沉淀；7.10 mmol/L Tris溶解上清；8.10 mmol/L Tris溶解沉淀

2.3 抗鸡LTBP1蛋白的单克隆抗体制备

纯化的重组LTBP1表达蛋白免疫小鼠4次后第10天，断尾采血分离血清，分别用IFA和iELISA检测免疫鼠血清多克隆抗体效价。IFA检测结果显示，5只免疫鼠均产生了较高的抗体效价，其中1号鼠和3号鼠IFA效价达到了1∶3 200(表1)。以纯化的LTBP1蛋白包被酶标板(20 μg/mL)，iELISA 检测结果显示，5只免疫鼠同样可检测到高效价抗体，其中1号免疫鼠血清iELISA效价最高，达到了1∶64 000(表2)。优先选择1号鼠进行超免，然后制备脾脏细胞进行细胞融合，杂交瘤生长9 d后取细胞上清用iELISA检测，挑选效价最高的杂交瘤细胞株3C11和2B1进行亚克隆，获得2株稳定分泌抗LTBP1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为3C11-A9和2B1-G7。用3C11-A9杂交瘤细胞株接种经产小鼠，成功制备了抗LTBP1蛋白的单克隆抗体腹水。

表1 免疫鼠多克隆抗体血清IFA效价

表2 免疫鼠多克隆抗体血清iELISA效价

2.4 抗鸡LTBP1单克隆抗体的IFA鉴定

用3C11-A9单克隆抗体腹水，分别对鸡源细胞CEF和DF-1进行IFA染色，结果显示，CEF和DF-1细胞与制备的3C11-A9株抗LTBP1单克隆抗体腹水反应后，均呈现特异性的绿色荧光染色(图3)，IFA效价最高可达到1∶8 000。

图3 CEF和DF-1细胞与3C11-A9单克隆抗体的IFA染色(100 ×)

2.5 抗鸡LTBP1单克隆抗体的Western blot鉴定

分别提取鸡源细胞CEF和DF-1的细胞间质蛋白，定量后以等量的蛋白质上样量(各20 μg)进行 SDS-PAGE电泳，转膜后以3C11-A9单克隆抗体腹水(1∶5 000)作为一抗，羊抗鼠 IgG-HRP(1∶1 000)作为二抗，进行Western blot鉴定。结果显示，虽然存在一些较弱的非特异性反应条带出现，但鸡CEF和DF-1的细胞间质蛋白均可与3C11-A9单克隆抗体产生很强的特异性反应，蛋白质条带大小约为187 ku，与预期的LTBP1蛋白大小相符(图4)。

图4 鸡LTBP1单克隆抗体的Western blot分析

2.6 鸡LTBP1单克隆抗体对哺乳动物细胞的IFA鉴定

分别制备传代细胞系293T、Hela、Vero、Cos-7、BHK-21、L929、PK-15和ST的细胞单层，用3C11-A9单克隆抗体腹水进行IFA鉴定。结果显示，上述8种哺乳动物细胞与制备的抗鸡LTBP1蛋白的单克隆抗体腹水反应后，均可呈现特异性的荧光染色(图5)。

图5 哺乳动物细胞系与3C11-A9单克隆抗体的IFA染色(100×)

3 结论与讨论

LTBP1是潜在性TGF-β结合蛋白家族的重要成员，作为分子伴侣可结合潜在性TGT-β，对于TGT-β从细胞内向细胞间质的转运、分泌、成熟以及TGF-β通路的信号传递极其重要，是TGF-β信号传递的总开关[16-19]。笔者所在课题组前期研究发现，鸡LTBP1基因是致瘤性禽疱疹病毒马立克病病毒(Marek’s disease virus,MDV)编码的原癌基因miR-155同源物miR-M4-5p调控的重要宿主靶基因[20]。为了进一步研究在MDV感染过程中，miR-M4-5p通过靶向下调LTBP1的表达，进而显著降低TGF-β1的分泌、抑制TGF-β通路信号传递并最终活化宿主癌蛋白c-MYC过表达的促瘤发生机制，先后购买了数种国内外商品化的LTBP1抗体产品。然而，这些抗体虽然与大多数哺乳动物细胞的LTBP1蛋白反应性良好，但无一抗体可与禽类细胞的LTBP1蛋白发生反应，这很可能是由于禽类与脊椎动物LTBP1基因同源性较低所致。本研究首先分析了禽类LTBP1与哺乳类LTBP1蛋白的序列同源性，结合哺乳动物细胞LTBP1蛋白的结构，选取两者较为保守的抗原性区域进行引物设计，利用PCR技术从CEF细胞中扩增了鸡LTBP1基因，成功构建了原核表达载体，并将纯化的重组蛋白免疫Balb/C小鼠后进行细胞融合，经过筛选获得了稳定分泌抗鸡LTBP1蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株3C11-A9和2B1-G7。经过IFA和Western blot鉴定，结果表明，制备的LTBP1单克隆抗体3C11-A9与鸡CEF和DF-1的细胞间质蛋白均可产生很强的特异性反应。虽然Western blot显示存在一些较弱的非特异性反应条带，但在以原核表达蛋白为免疫原制备的抗体反应中属于常见现象。进一步的试验表明，3C11-A9不仅可特异性识别禽源细胞CEF和DF-1表达的LTBP1蛋白，而且与其他多种哺乳动物(人、猴、鼠、猪)来源的细胞系表达的LTBP1蛋白反应特异性良好，可以同时满足哺乳类和禽类LTBP1蛋白及TGF-β信号通路相关的功能研究。