刘文雄 莫善颖

疟疾是一种在热带及亚热带地区广泛流行，由于被雌性按蚊叮咬或输入了带有患者的血液而被疟原虫感染所致的虫媒传染性疾病，尤其处于疫区的幼儿、孕妇、老年人、机体免疫能力和抵抗能力差等人群均属于易感人群。按蚊叮咬、血液传播和母婴传播是感染疟疾的主要途径，疟疾的发病过程是疟原虫进入人体，入侵肝细胞后生长发育，并进入血液中的红细胞持续繁殖，最终导致红细胞破裂。疟疾的常见表现为突发性寒战、全身高热、大量出汗并伴随头晕、头痛、身体酸痛、疲乏、厌食、呕吐等症状，病情严重者会出现昏迷、休克、代谢性酸中毒、急性肾功能衰竭或急性肺水肿等表现，导致人体器官组织受到严重损伤，也给人们的生命安全造成较大威胁［1-2］。疟疾是一种世界范围的传染病，目前在亚洲和非洲地区仍然是威胁人类健康最严重的寄生虫疾病之一［3］，且病例主要集中在非洲和东南亚地区［4］。目前全球104 个疟疾流行国家和地区中已有19 个国家和地区正处于消除疟疾前阶段或消除疟疾阶段［5］。

近年来，疟疾得到很好的控制，病例数大幅下降,但仍有部分病例因延误诊治而导致患者死亡。因此，寻求精确、快速的诊断方法是控制疟疾传播以及降低治疗成本和病死率的关键。外周血涂制厚、薄血膜镜检法目前在世界范围内仍被广泛应用，已成为疟疾实验室诊断的“金标准”［6］，但传统的镜检法结果受诸多因素影响，容易造成误诊或漏诊，作为“金标准”已越来越难以用于评价诊断效率［7］。因此，本文对近年来国内外疟疾诊断方法的研究进展进行简要概述。

1 病原学诊断

1.1 镜检法 使用镜检法理论上每μL 血液样本中可检出4 个疟原虫［8］，但该方法费时、费力，对低原虫血症和混合感染容易漏诊，但因操作简单，经济实用，仍是基层单位检测疟疾的主要手段。

1.2 吖啶橙包被的毛细管法（quantitative buffy coat technique，QBC） 该方法利用受感染的红细胞比正常红细胞轻，但比白细胞略重这一原理，使用含抗凝剂和吖啶橙荧光染液的毛细管采集末梢血，经分层离心后，被染色的红细胞富集于棕黄色层下。QBC法的优点在于检测速度快，敏感度和特异度均较高，但该方法对虫株的鉴别和计数较困难，操作步骤多，耗材费用高［9-10］。

1.3 苯并硫羟基嘌呤（benzothiocarboxypurine，BCP）染色法 对各发育期的疟原虫进行染色，被感染的网织红细胞可见独特的点状分布，白细胞的细胞质呈亮绿色，存活的白细胞及血膜中的异物不着色，因此易于镜检者的观察和区别。Makler 等［11］首次采用BCP 法对恶性疟原虫进行荧光染色检查，该方法的敏感度与姬姆萨染色法基本一致。随后，张庆军［12］研究结果显示，BCP 法的检测敏感度较高，且该方法操作简便、快速，且染色稳定性高于姬姆萨染色法，不易过染，较易识别，镜检快速，对镜检者的技术要求低。

1.4 吖啶橙（acridine orange，AO）染色法 AO 是一种非常敏感的核酸荧光染料，含DNA 和RNA 的细胞在染色后分别激发黄绿色荧光和橘红色荧光，根据染色后所呈现的颜色对病原体进行鉴别。早在20 世纪90 年代初期，Kawamoto［13］就设计了AO滤色系统和卤素光源，使之可以在传统光学显微镜下进行观察，从而在临床上得到广泛应用。黄亚铭等［14］研究表明，AO 染色法比传统检测方法的速度快，阳性率高。另外，AO 染液有毒性，检验人员在操作时需戴手套和避光，AO 法还存在染色无特异性的缺点，因此镜检人员应接受相关培训。

2 免疫学诊断

2.1 间接免疫荧光抗体法（indirect immunofluorescent antibody test，IFAT） IFAT 是在待测血清抗体与抗原结合后，加入荧光标记的第二抗体，洗涤后在荧光显微镜下观察特异性荧光。该方法具有较高的敏感度和特异度，且重复性较好，但有一定主观性，标本无法保存。房文等［15］研究显示，随着存放温度的上升和存放时间的延长，抗体量逐渐下降，需在荧光显微镜下观察，且只有高滴度IFAT 才适用于无症状带虫者的确定和临床诊断［16］。

2.2 酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA） 将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，以酶标记的抗原或抗体与黏附在载体上相应的抗体或抗原结合，用洗涤法将液相中的游离成分洗除，再与酶底物作用，根据底物显色深浅定性、定量检测抗原和抗体。该方法敏感性好，特异性强，稳定性高，且由其衍生出斑点ELISA（Dot-ELISA）等一系列方法，均可用于临床检验。李全贞等［17］的研究表明，直接检测患者血清中疟原虫抗体，可减少筛选的盲目性，而且简便、快速，适合于大规模疟原虫抗体的筛选。

2.3 免疫层析技术

2.3.1 恶性疟原虫富组氨酸蛋白2（histidine-rich protein-2，HRP-2）抗原检测 该方法是一种直接检测血液中恶性疟原虫HRP-2抗原(一种可溶性蛋白)的免疫吸附定性测试，ParaSight-F 浸条法和快速免疫色谱测试法（immunochromatographic test，ICT）是近年来应用较多的两种检测疟原虫HRP-2 抗原的方法。杨亚明等［18］对ParaSight-F 浸条法与PCR 进行比较，结果显示ParaSight-F 浸条法操作简便，无需特殊设备，且检测效果较好，7～10 min 即可获得诊断结果。郑香等［19］与张再兴等［20］比较ICT 法与镜检法，结果显示两种方法的符合率高，操作快速方便。ParaSight-F 法只能检测恶性疟原虫，而ICT法还可检测间日疟原虫及混合感染。当类风湿因子（rheumatoid factor，RF）存在时，ParaSight-F 法与ICT 法会出现假阳性结果，且假阳性率随着RF 滴度的增加而升高［21］。有学者使用胶体碳作为免疫层析的信号标签，与镜检法进行比较，其敏感度、特异度、符合率均可达到95%以上，扫描检测带的灰度值能够实现对疟原虫的定量检测［22］。免疫层析技术目前也应用于很多其他感染性疾病的检测，如流行性感冒、社区获得性肺炎等［23］。

2.3.2 乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）抗原检测 单克隆抗体免疫层析法（OptiMAL）原理是用LDH 单克隆抗体捕获溶于血液中的LDH 抗原，由于血液中LDH 的水平与虫体血症存在相关性，可作为疟原虫检测的标志物。雷露等［24］研究中，单克隆抗体免疫层析法、镜检法和PCR 法在102 份疟疾疑似病例血样的检测中阳性率分别为63.73%、54.90%、70.59%，单克隆抗体免疫层析法和PCR 法的阳性率均高于镜检法。在常规疟疾检测工作中，单克隆抗体免疫层析法或PCR 法均可作为镜检法的有效补充，能进一步提高疟疾病例的临床诊断水平。焦炳欣等［25］还认为OptiMAL 法可反映药物治疗后疟原虫数量的下降，能够评估治疗效果和鉴定抗药疟原虫株的出现。

2.3.3 谷氨酸脱氢酶（glutamate dehydrogenase，GDH）抗原检测 GDH 以其独特的物理化学性质成为用于疟疾诊断新的候选分子，李妍等［26］建立的GDH胶体金层析法检测恶性疟的敏感度为86.66%，特异度为96.43%。

3 聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）

3.1 普通PCR 该技术原理与细胞内的DNA 复制相似，是一种体外快速扩增靶基因或DNA 序列的方法。目前，PCR 技术已广泛应用于病原体诊断、基因表达、遗传病检测等生命科学研究领域［27］。华德等［28］应用普通PCR 技术对保存1～5 年的血样进行检测，PCR 结果与原镜检结果的总符合率为98.4%，表明长期保存标本不影响PCR 结果。

3.2 实时荧光定量PCR 该技术是在普通PCR 的基础上发展起来的核酸荧光定量技术。实时荧光定量PCR 的检测敏感度可达到每μL 血液0.2～4.0 个疟原虫［29］。张国斌［30］采用镜检和实时荧光PCR分别检测疟原虫阳性和阴性血样各20 份，实时荧光定量PCR 在检测时具有快速、准确度高、阳性检出率高的特点。李素华等［31］将实时荧光PCR 与镜检和巢式PCR 进行比较，荧光定量PCR 的阳性检出率为93.7%，高于其他两种方法，且敏感度和特异度更高，用时更短。

3.3 巢式PCR 该技术利用两对PCR 引物进行两次PCR 扩增，从而使靶序列得到两轮扩增，可增加PCR 检测技术的敏感度和特异度。Yentur Doni 等［32］采用巢式PCR 和显微镜观察两种方法对153 例疑似疟疾患者血样进行检测和比较发现，巢式PCR检出阳性标本15 份（占9.8%），显微镜观察检出阳性标本11 份（占7.2%），两种方法的阳性符合率为73.3%。吴冬妮等［33］对疟疾快速诊断试剂盒（rapid diagnostic tests，RDTs)、显微镜检法和巢式PCR 3 种方法进行比较分析，在恶性疟原虫的鉴定能力上，RDTs 最佳，符合率为100.00%；巢式PCR 次之，符合率为97.49%；镜检法的符合率为91.40%。

3.4 多重PCR 多重PCR 又称多重引物PCR 或复合PCR，是以传统PCR 技术为基础，可同时检测两对以上疟原虫的引物，对多个DNA 模板或不同区域片段进行扩增，从而减少操作步骤，且省时省力［34］。黄雨婷等［35］对间日疟原虫、恶性疟原虫、卵形疟原虫和三日疟原虫进行单一及混合疟原虫DNA 模板检测，结果显示，4 种疟原虫单一感染检出的最低浓度均接近每μL 血液中1 个疟原虫。魏晓光等［36］用多重PCR 法和荧光定量PCR 法对55 例临床疟疾病例标本进行检测，其中多重PCR 法检出疟原虫42 份，阳性率为76.36%，荧光定量PCR 法检出疟原虫41 份，阳性率为74.55%,两种PCR 方法的敏感度、特异度均较高，有较高推广应用价值。上述研究结果均提示，多重PCR 方法具有敏感度和特异度高、操作简便快速、检测结果易于判断的优点，一次反应即可确定4 种人体疟原虫。

3.5 多重荧光定量PCR 该技术由实时荧光PCR与多重PCR 优化发展而来，通过将几种不同的探针荧光基团混合，可同时检测基因序列不同的疟原虫。何晓翔等［37］研究表明，恶性疟疾可检测到每mL 102个拷贝，间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫可检测到每mL 103个拷贝。多重荧光定量PCR 检测4 种疟原虫的特异度较高，重复性较好，且敏感度较高，可用于疟原虫快速筛查及分型鉴定。

4 结语

目前以传统镜检法为基础的病原学诊断方法仍是疟疾诊断的“金标准”，具有价格低廉、对设备要求低、易于基层开展等优点，但其敏感度低，且费时费力，需要有相当经验的人员才能做出正确的诊断。另外，低疟原虫血症和混合感染也使传统的诊断方法不能适应现代疟疾监控的要求。

近年来，疟疾诊断技术在免疫学和PCR 技术方面均有较大的发展。在免疫学方面，免疫层析技术操作简单、快速，使实验室外的患者自我检测成为可能，较适合现场人群筛查，但其敏感度较低，检测无症状带虫者时易出现假阴性结果。在PCR 技术应用方面，PCR 对疟原虫诊断及虫种鉴定均具有较高的敏感度和特异度，特别是对于低密度疟原虫感染的病例较容易检测到［5］；但PCR 检测技术需要特殊的设备，且仪器体积较大，不易移动，不利于现场应用，检测操作较费时，成本较高，因此该技术适用于医疗设备条件好且技术人员充足的大型医院，而在基层单位的推广仍面临很大困难。

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