王俊力， 杨 运， 邵 卫， 罗卫东， 张忠文， 梅俊华， 陈国华

华中科技大学同济医学院附属武汉市中西医结合医院神经内科，武汉 430022

毒邪作为一类重要的致病因素，既可由外侵入，又可由内产生，与多种疾病的发生和演变密切相关。随着分子生物学的发展，人们对毒邪致病的认识也在不断深入，“内生毒邪”的病因病机逐渐被广为接受，如王永炎院士提出：“中风后常有瘀毒、痰毒、热毒互结，破坏形体，损伤脑络”，从而在对脑病的认识中形成了“毒损脑络”的学术观点[1]。

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)[2]是发生于老年和老年前期，以进行性认知功能障碍和行为损害为特征的中枢神经系统退行性病变，属于中医痴呆范畴。现代医学研究表明，β-淀粉样蛋白(amyloid β peptide，Aβ)在脑内的过度沉积会激活小胶质细胞产生神经免疫炎症反应，引起神经元内稳态异常及氧化损伤，使tau蛋白过度磷酸化，形成神经纤维缠结，导致胆碱神经元选择性丢失伴神经递质分泌减少而出现临床痴呆[3-6]，同时小胶质细胞分泌的促炎细胞因子及炎性介质是神经系统退行性病变的重要影响因素[7]。而对于AD的中医病机，现代部分医家认为脑为“清灵之府”，最忌秽气浊毒，年迈体弱、脏腑虚衰再加外邪侵袭，人体脏腑功能失调，气血津液运行失常，体内的痰浊、瘀血等不能及时排出，郁蒸腐化，化热成毒，浊毒内生，毒损脑络，导致脑窍壅塞、神机失用而发为痴呆[8-9]。现代医学的病理生理机制与中医学的病因病机学说有不谋而合之处：Aβ沉积形成的老年斑、神经元内tau蛋白过度磷酸化形成的神经纤维缠结，以及各种具有神经元毒性的病理产物均属于“内生毒邪”范畴[10]。与毒邪相对应的中医解毒治法应该具有明确的疗效，目前的诸多研究也表明清热解毒法能够有效改善免疫炎症反应所带来的机体损害，然而这种毒邪及清热解毒法在痴呆发病及治疗中的作用机制仍不明确。因此本研究通过脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导BV2小胶质细胞活化建立体外神经炎症模型，探讨黄连解毒汤含药血清对神经炎症反应的保护作用，以期为清热解毒法治疗AD提供科学实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物和细胞

SPF级雄性SD大鼠20只，体质量(250±20)g，购自三峡大学实验动物中心，合格证号：No.42010200001292。BV2小胶质细胞株购自武汉大学中国典型培养物保藏中心(资源编号：3142 C0001000000337)。本实验经武汉市第一医院实验动物伦理委员会批准。

1.2 药品与主要试剂

中药材黄连、黄芩、黄柏、栀子购于武汉市第一医院中药房(湖北天济中药饮片有限公司提供)，武汉市第一医院制剂中心制作黄连解毒汤浸膏，本课题组质控后备用；高糖DMEM培养液(货号：SH30022.01)、青霉素和链霉素(货号：SV30010)、0.25%胰蛋白酶(含EDTA，货号：SH30042.01)购于Hyclcone公司；胎牛血清(FBS)购于Gibco公司(货号：04-121-1)；NO检测试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司(货号：S0024)；小鼠白细胞介素-6(IL-6)及白细胞介素-1β(IL-1β)ELISA试剂盒均购于深圳欣博盛生物科技有限公司(货号：EMC004.96，EMC001b.96)；RNAiso Plus、Prime ScriptTMRT Master Mix逆转录试剂盒和SYBRTMPremix Ex Taq TMⅡ购于TaKaRa公司(货号：D9108A，RR047A，RR820A)；兔来源MyD88多克隆抗体(分子量33 kD，货号：AF5195，稀释度1∶1000)、兔来源TLR4单克隆抗体(分子量95 kD，货号：Ab13556，稀释度1∶500)购于Affinity公司；兔来源NF-κB p65多克隆抗体(分子量65 kD，货号：Ab16502，稀释度1∶2000)、兔来源IκBa多克隆抗体(分子量36 kD，货号：Ab7217，稀释度1∶2000)、兔来源p-IκBa单克隆抗体(分子量35 kD，货号：Ab133462，稀释度1∶10000)、兔来源p-NF-κB p65多克隆抗体(分子量60 kD，货号：Ab106129，稀释度1∶1000)和兔来源GAPDH单克隆抗体(分子量36 kD，货号：Ab181602，稀释度1∶10000)均购于Abcam公司；HRP标记山羊抗兔IgG二抗(货号：A21010)购于EARTH公司。

1.3 BV2小胶质细胞培养及分组处理

选用高糖DMEM培养液(含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素)培养BV2小胶质细胞株，培养箱条件为37℃、5%CO2，按照BV2小胶质细胞生长情况，每隔1～2 d更换培养液。

取对数生长期BV2小胶质细胞，分为5组：10%空白大鼠血清组(Control组)、10%空白大鼠血清+LPS组(Control+LPS组)、黄连解毒汤含药血清(5%、10%、20%)+LPS组(HLJDD+LPS组)；各组LPS浓度均为1 μg/mL，各HLJDD+LPS组用对应含药血清预处理1 h后再加入LPS作用24 h，完成后续实验。

1.4 黄连解毒汤含药血清及大鼠对照血清制备

SPF级SD大鼠适应性喂养5 d，随机分为大鼠对照血清组和黄连解毒汤组，每组10只，分别给予生理盐水和黄连解毒汤灌胃(1 mL/100 g，2次/d)，连续6 d；第6天第1次给药后1 h，以水合氯醛腹腔麻醉实验大鼠，经心脏采集全血并分组混匀，静置1 h后3000 r/min离心15 min分离血清，56℃水浴30 min灭活，微孔滤膜过滤除菌，冻存管分装，-70℃保存备用；黄连解毒汤含药血清以高糖DMEM培养液配制成5%、10%、20%浓度备用，大鼠对照血清以高糖DMEM培养液配制成5%浓度备用。

剂量换算：依据实验动物与人的体表面积比例表[11]进行剂量换算，70 kg人的等效剂量相当于200 g大鼠的56倍，故黄连解毒汤组SD大鼠灌胃剂量=30÷56÷0.2=2.678(g/kg)。

1.5 实时荧光定量PCR(qPCR)检测TLR4、MyD88、IκBa和NF-κB p65 mRNA表达

BV2小胶质细胞接种于6孔板(2.5×105个/孔)中，细胞分组及处理同上。按照RNA提取试剂盒说明书提取各组细胞总RNA，经分光光度计测定浓度和纯度后，进行逆转录合成cDNA(反应体积20 μL)。以cDNA为模板进行PCR扩增，反应条件为：95℃ 1 min预变性，95℃ 15 s，58℃ 20 s，72℃ 20 s，循环40次；72℃末段延伸5 min。熔解曲线：72℃～95℃，每20 s升温1℃。所用引物序列见表1，每组设3个复孔，使用GAPDH作为内参，采用2-ΔΔCt法计算目的基因的表达值。

表1 qPCR检测所用引物序列Table 1 Primers used in qPCR detection

1.6 Western blot检测TLR4、MyD88、p-IκBa、IκBa、p-NF-κB p65和NF-κB p65蛋白的表达

BV2小胶质细胞接种到6孔板(2.5×105个/孔)中，按不同分组进行处理。各组弃去培养液，无菌PBS清洗3次，加入蛋白酶抑制剂与RIPA裂解缓冲液的混合液提取各组细胞总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度，计算含40 μg蛋白的溶液体积即为上样量。加入5×蛋白上样缓冲液，100℃水浴5 min变性。取各组蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜后加入5%脱脂奶粉(0.5%TBST配制)常温摇床封闭1 h。分别加入兔抗GAPDH单克隆抗体、兔抗TLR4、MyD88、p-IκBa、IκBa、p-NF-κB p65和NF-κB p65抗体(各抗体稀释倍数如前所述)，4℃孵育过夜。0.5% TBST洗膜10 min×3次，加入HRP标记山羊抗兔IgG二抗(抗体稀释倍数如前所述)室温下孵育30 min，0.5%TBST洗膜10 min×3次，加入等体积混匀的ECL化学发光试剂A和B，均匀滴加到膜的蛋白面，保持1～2 min后放入凝胶成像仪中曝光成像，应用Image J软件进行各样本条带灰度值统计分析，结果以目的蛋白条带与GAPDH条带灰度值的比值表示。

1.7 ELISA法检测IL-1β和IL-6含量

BV2小胶质细胞接种到96孔板中(5×104/mL，每孔100 μL)，按不同分组进行处理。收集各组细胞培养上清液，用ELISA试剂盒检测IL-1β和IL-6水平，具体操作按ELISA试剂盒说明书进行。用酶标仪测定450 nm处的吸光度值，建立标准曲线，根据标准曲线计算细胞培养上清中IL-1β和IL-6的含量。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 黄连解毒汤含药血清对LPS诱导BV2小胶质细胞TLR4、MyD88、IκBa和NF-κB p65 mRNA表达的影响

qPCR检测结果显示：与Control组比较，Control+LPS组细胞TLR4、MyD88、IκBa和NF-κB p65 mRNA的表达均明显增加，差异有统计学意义(均P<0.05)；而不同浓度黄连解毒汤含药血清(5%、10%、20%)预处理后，BV2小胶质细胞TLR4、MyD88、IκBa和NF-κB p65 mRNA的表达均受到抑制，与Control+LPS组比较，差异均具有统计学意义(均P<0.05)，且抑制作用在实验浓度范围内呈浓度依赖性(图1)。

2.2 黄连解毒汤含药血清对LPS诱导BV2小胶质细胞TLR4、MyD88、p-IκBa、IκBa、p-NF-κB p65和NF-κB p65蛋白表达的影响

Western blot检测结果显示：与Control组比较，Control+LPS组BV2小胶质细胞TLR4、MyD88、p-NF-κB p65和IκBa蛋白的表达均明显增加，差异有统计学意义(均P<0.05)；而与Control+LPS组比较，黄连解毒汤含药血清预处理后的BV2小胶质细胞TLR4、MyD88、p-NF-κB p65和IκBa蛋白的表达下降，差异有统计学意义(均P<0.05)。与Control组比较，Control+LPS组BV2小胶质细胞NF-κB p65和p-IκBa蛋白表达减少，差异有统计学意义(均P<0.05)；而与Control+LPS组比较，黄连解毒汤含药血清预处理后的BV2小胶质细胞NF-κB p65和p-IκBa蛋白的表达增加，差异有统计学意义(均P<0.05)(图2)。

与Control组比较，*P<0.05；与Control+LPS组比较，#P<0.05图1 荧光定量PCR检测TLR4、MyD88、IκBa和NF-κB p65 mRNA表达变化Fig.1 Fluorescent quantitative PCR for detection of relative mRNA expression of TLR4，MyD88，IκBa and NF-κB p65

1：Control组；2：Control+LPS组；3：HLJDD(5%)+LPS组；4：HLJDD(10%)+LPS组；5：HLJDD(20%)+LPS组；与Control组比较，*P<0.05；与Control+LPS组比较，#P<0.05图2 各组BV2小胶质细胞TLR4、MyD88、p-IκBa、IκBa、p-NF-κB p65和NF-κB p65蛋白表达变化Fig.2 Changes of TLR4，MyD88，p-IκBa，IκBa，p-NF-κB p65 and NF-κB p65 protein expression in BV2 microglia in each group

2.3 黄连解毒汤含药血清对LPS诱导BV2小胶质细胞IL-1β和IL-6分泌的影响

ELISA检测结果显示(图3)：与Control组比较，Control+LPS组BV2小胶质细胞上清液中IL-1β和IL-6的浓度均明显增高，差异有统计学意义(均P<0.05)；而不同浓度黄连解毒汤含药血清(5%、10%、20%)预处理后，BV2小胶质细胞上清液中IL-1β和IL-6的浓度显著下降，与Control+LPS组比较差异均具有统计学意义(均P<0.05)。

与Control组比较，*P<0.05；与Control+LPS组比较，#P<0.05图3 各组BV2小胶质细胞培养上清中IL-1β和IL-6含量Fig.3 Changes of IL-1β and IL-6 in BV2 microglia in each group

3 讨论

中枢神经系统内的神经炎症级联反应是AD等神经退行性疾病的重要特征[12]。小胶质细胞是中枢神经系统的固有免疫防御细胞，β-淀粉样蛋白沉积激活小胶质细胞介导的神经炎症反应是AD的核心病理机制[13-15]。既往研究表明，AD患者及实验动物模型中均可观察到β-淀粉样蛋白周围聚集有处于激活状态的小胶质细胞[16-17]，小胶质细胞分泌释放多种炎性因子，对神经元产生毒性损伤[18-19]。中枢神经系统内，小胶质细胞被激活后主要分化为发挥促炎作用的M1型和起抗炎作用的M2型[20-22]，因此，调控小胶质细胞的激活是AD预防及治疗的主要研究靶点之一。

黄连解毒汤是清热解毒法的代表方剂，葛洪《肘后备急方》首次记载了其药物组成，后经唐朝王焘在《外台秘要》中冠名为黄连解毒汤。本方由黄连、黄芩、黄柏、栀子四味中药按3∶2∶2∶3的比例配伍组成。方中以黄连为君，泻中焦之火，清心经之热；黄芩为臣，泻上焦之火，清肺热；黄柏为佐，泻下焦之火，清肾经虚热；栀子为使，通泻三焦之火，导火下行；四药合用，苦寒直折，使火邪去而热毒解，主治一切实热火毒、三焦热盛之证[23]。我们前期临床研究发现[9]，黄连解毒汤可改善老年性痴呆(心肝火旺型)患者的智力和生活能力，延缓临床症状的进展；同时既往研究证实黄连解毒汤相关中药的活性成分具有抗氧化、抗炎、免疫调节等作用[24-25]，但目前其调控神经炎症反应的机制尚未阐明。

本课题组前期通过LPS诱导BV2小胶质细胞建立体外神经炎症模型[26]发现，BV2小胶质细胞过度活化可激活TLR4信号通路，促进IL-1β和IL-6炎症因子的分泌；TLR4信号通路主要通过其衔接蛋白MyD88/NF-κB和TRIF途径下传信号，其中MyD88/NF-κB途径是经典信号传导途径。LPS等刺激后，经过细胞内复杂的信号转导途径，激活MyD88，可诱发细胞质中无活性状态NF-κB相关蛋白的磷酸化，促使NF-κB向核内转位，激活相应的靶基因，诱导多种促炎因子的表达，形成正反馈放大炎症反应。故本实验采用LPS诱导BV2小胶质细胞活化建立体外神经炎症模型，运用此模型探讨黄连解毒汤含药血清对神经炎症反应的保护机制，实验结果显示LPS诱导BV2小胶质细胞过量表达TLR4、MyD88、IκBa和NF-κB p65 mRNA，而黄连解毒汤含药血清能有效抑制上述信号分子mRNA的表达；同时LPS诱导BV2小胶质细胞过度活化可增高TLR4、MyD88、p-NF-κB p65和IκBa蛋白的表达，减少NF-κB p65和p-IκBa蛋白的表达，而黄连解毒汤含药血清预处理后可抑制TLR4、MyD88、p-NF-κB p65和IκBa蛋白的表达，增加NF-κB p65和p-IκBa蛋白的表达；此外BV2小胶质细胞在LPS诱导下分泌释放炎症因子IL-1β和IL-6的水平显著增加，而黄连解毒汤含药血清预处理后上述炎症因子的分泌明显减少。

综上所述，LPS诱导BV2小胶质细胞过度活化可诱发IκBa和NF-κB p65蛋白磷酸化，NF-κB p65核转位，促进IL-1β和IL-6炎症因子的分泌；而黄连解毒汤含药血清可抑制TLR4及MyD88的表达，影响IκBa降解和NF-κB p65核转位而发挥抗炎保护作用，即黄连解毒汤含药血清可能通过TLR4/NF-κB信号通路来进行调控，初步阐明了黄连解毒汤的抗炎保护作用机制，为中医清热解毒法预防及治疗AD等神经炎症相关性疾病提供了理论依据。由于时间和经费的限制，本实验仅运用体外实验探讨了黄连解毒汤的抗炎保护作用机制，并未运用体内实验去观察黄连解毒汤对AD动物行为学及病理改变的影响，这将是我们今后进一步研究的方向之一。