徐惠龙，刘江明，范小芳，许文，范世明

福建中医药大学 药学院，福建 福州 350122

三叶青系为葡萄科植物三叶崖爬藤TetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg，主要分布于福建、浙江和广西等南方省区[1]，以其块根入药，具有清热解毒、祛风化痰和活血止痛功效[2]，而民间亦有以全草、茎及叶入药的习俗[3-4]，含有儿茶素、原花青素B1和山柰酚-3-O-芸香糖苷等多种黄酮类成分[5-8]，有抗肿瘤、抗病毒、抗炎等特性[9-10]。三叶青是多年生藤本阴生植物，在完全日照下生长不良或者不能生长，适宜生长在遮光度为50%～90%的荫蔽环境中[11]。研究显示，光照强度影响三叶青蒸腾作用、气孔导度和光合作用[12]，>50%自然全光照时，三叶青光合作用和生长受到抑制[13]，约30%自然全光照时，三叶青块茎产量及其总黄酮含量达到最高[14]。提示光照条件是调控三叶青植株及块根生长发育、黄酮类化合物形成与积累的重要因素。

1 材料与方法

1.1 材料

UV1800型紫外-可见分光光度计(日本岛津公司)；电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；十万分之一分析天平(德国Sartorius公司)；SPAD-502型叶绿素计(日本柯尼卡美能达感应公司)。

芦丁对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110774-201113)；甲醇(德国Merck 公司，色谱纯)；水为超纯水；氢氧化钠、亚硝酸钠和硝酸铝为分析纯。

课题组筛选的优良种质资源三叶青“闽选1号”扦插种苗，由福建中医药大学药用植物实验室范世明正高级实验师鉴定为葡萄科植物三叶崖爬藤T.hemsleyanumDiels et Gilg的种苗。

1.2 试验设计

2017年1月上旬，在福建中医药大学时珍园(药用植物园)大棚内开展试验，选取生长一致的三叶青“闽选1号”扦插苗移植于控根容器中(直径50 cm，高30 cm)，土壤均为沙壤土，用黑色遮阳网遮阴生长适应2个月。

本研究设置不同光照强度3个水平，分别为自然光照的5%～10%(A处理)、20%～30%(B处理)、30%～45%(C处理)，约每隔45 d(共8次，用①～⑧表示)进行随机取样，分别测定各样品叶、藤茎及根的质量。

1.3 测定指标和方法

1.3.1叶绿素含量的测定 采用SPAD-502型叶绿素计测定叶绿素相对含量。

1.3.2叶、藤茎和根总黄酮含量的测定 以芦丁为对照品测定供试样品总黄酮含量[15-17]，精密称取芦丁44.80 mg于100 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容得对照品溶液。分别吸取对照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL 置25 mL量瓶中，甲醇定容至5 mL，加 15% 亚硝酸钠溶液1 mL，混匀，静置6 min，加10% 硝酸铝溶液1 mL 混匀，静置6 min，加10% 氢氧化钠溶液10 mL，混匀，甲醇稀释至刻度，静置15 min。以不加芦丁的样品作空白，检测波长500 nm，得回归方程：Y=0.013X-0.015 2(r=0.999 3)。精密称取供试品粉末2.00 g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇50 mL，超声提取2次，每次30 min，然后进行反应，500 nm 波长测定样品黄酮含量。

1.4 数据处理

数据处理采用Excel 2007和SPSS 20.0 软件。

2 结果

2.1 不同光照强度对三叶青生长发育的影响

三叶青植株形态随着光照强度增加发生适应变化。如图1所示，不同遮阴处理360 d后，植株外部形态特征差异较大，A处理植株藤茎较长，叶生长较为茂盛，深绿色，根系较少；B处理藤茎生长一般，叶浅绿色，根系生长旺盛，有较多块根；C处理藤茎生长缓慢，叶较小、浅黄色，根系生长旺盛，须根长而多，偶见小块根。

注：A.自然光照5%～10%的三叶青藤茎和叶；B.自然光照20%～30%的三叶青藤茎和叶；C.自然光照30%～45%的三叶青藤茎和叶；D.自然光照5%～10%的三叶青根系；E.自然光照20%～30%的三叶青根系；F.自然光照30%～45%的三叶青根系；箭头标注三叶青块根。图1 不同光照强度下三叶青植株形态

从表1可知，三叶青植株的生物量都呈现上升的趋势，不同光照强度处理对三叶青生物量的影响较大。在①～⑦时期，茎叶(地上部)干质量：A>B>C，在⑤～⑧时期，C处理三叶青叶和藤茎生物量都明显比A和B处理的少(P<0.05)；在⑧时期C处理的叶生物量都明显比B处理少(P<0.05)，说明光照强度太高不利于叶子的生长。在①～⑦时期，根(地下部)干质量C>B>A；在④～⑧时期C处理的根生物量明显比A处理多(P<0.05)，B处理也比A处理也有明显增多；而到了⑧时期，根干质量B处理明显大于A和C处理(P<0.05)，说明适宜的光照强度更有利于根系的生长。

表1 不同光照强度和时间下三叶青生物量 g

2.2 不同光照强度对三叶青叶绿素含量的影响

从图2可知，不同光照强度对三叶青叶片叶绿素含量影响存在差异，各生长期叶绿素均表现出A>B>C趋势。说明随着光照强度的增加，三叶青叶片的叶绿素含量逐渐下降，这可能导致其光合作用能力下降，是造成其藤茎生物量下降的原因。

注：不同小写字母表示各处理样品中叶绿素含量差异有统计学意义(P<0.05)。图2 不同光照强度下三叶青叶绿素含量

2.3 不同光照强度对三叶青叶、藤茎及根总黄酮含量的影响

黄酮类成分是三叶青主要次生代谢产物，也是其主要药效成分。如图3～5所示，①～⑧时期，A、B、C处理中三叶青叶总黄酮含量都有不同程度的增加，且均为C>B>A；虽然在①～⑧时期，三叶青藤茎中的总黄酮含量变化不稳定，但不同时期中均为C>B>A；在①～⑤时期，A、B、C处理中三叶青根中总黄酮含量呈上升的趋势；在⑥～⑧时期，先下降后上升；但在①～⑧时期，三叶青根总黄酮含量均为C>B>A。说明随着光照强度的增加，三叶青各部位总黄酮均表现出上升的趋势。

图3 不同光照强度下三叶青叶总黄酮质量分数

图4 不同光照强度下三叶青藤茎总黄酮质量分数

图5 不同光照强度下三叶青根总黄酮质量分数

3 讨论

3.1 不同光照强度对三叶青生长发育的影响

植物通过光合作用合成碳水化合物等主要能量产物，在不同的光强下，植物的叶绿素含量、光合特性发生相应的变化，其生物量及生长发育会受到不同程度的影响[18]。研究显示，遮阴处理有利于三七等喜阴药用植物的生长发育，与全日照相比，遮阴条件下其生长速度加快、生物量明显增长、叶面积增大、叶色深绿、叶片的叶绿素含量增加、叶片净光合速率升高等[19]。适宜的光照条件有利于三叶青植株及块根生长发育，如23 μmol·m-2·s-1的光强有利于三叶青腋芽外植体的萌发[20]。

本研究表明，三叶青植株的总生物量都随着时间的推移呈现增长的趋势，地上部分的A处理生物量明显优于B和C处理，这可能是三叶青喜凉爽气候的习性有关，A处理遮光密度大，比较阴凉，有利于其茎叶的生长，所以A处理的三叶青地上部分生物量较大；地下部分却是B与C处理的生物量明显优于A处理，这可能是根系的生长与光照强度有关，C处理光照强度最强，温度较高，土壤含水量相对较低，植株响应光照过强而表现出的适应性生长，所以根系生长较旺；而B处理地下块根明显优于A与C处理，这可能是由于适度的光照条件有利于三叶青地下块根的形成与膨大。各时期A处理三叶青的叶片叶绿素含量高于B与C处理，这与图1中其叶片的颜色特征相吻合，而A处理地上部生物量较高，说明较低的光照强度条件更有利于三叶青进行光合作用和茎叶生长；①～⑥时期叶绿素含量呈现明显的增长趋势，⑦时期明显降低，在⑧时期又明显上升，究其原因，⑥～⑦处于冬季时期，可能是由于气温较低影响叶绿素的形成，植物进入休眠状态，⑦时期以后，气候温暖、阳光充足，故而后期的叶绿素含量又急剧上升。

3.2 不同光照强度对三叶青总黄酮含量的影响

植物化学成分的形成和积累受光照强度的调控，光强不足可限制植物的光合作用，减少碳源产物的合成，致使其生长受阻，而光强过强则会损伤光合器官[21-22]。对药用植物而言，光照强度影响其黄酮类等次生代谢产物的合成。银杏幼苗叶和三叶青块根总黄酮含量随光照强度变化而改变，在透光度约为30%时，其总黄酮含量最高，而强光或过度遮阴，总黄酮含量均下降，认为适度光照强度有利于黄酮类化合物的的合成与积累[23]。

本研究表明，在不同生长时期中，三叶青的总黄酮含量均表现为叶>藤茎>根，而叶片作为植物进行光合作用的场所，随着光照强度的增强，三叶青植株可能为了响应这种环境条件的改变，叶片中的光合产物转化为黄酮类化合物，从而适应光照强度的升高。对于阴生植物的三叶青而言，其叶片所接受光照强度范围的筛选是最关键的栽培调控措施。从⑤～⑧时期，三叶青叶总黄酮含量随着光强的增加而上升，B或C处理与A处理差异有统计学意义，而B处理和C处理之间差异无统计学意义，这表明三叶青叶中黄酮类化合物的合成需要较高的光照强度；①～⑧时期，相对于A或B处理，C处理可以显著性提高三叶青根总黄酮含量，说明较高的光照强度可以促进黄酮化合物合成及转运。

3.3 三叶青适宜光照强度的栽培技术

药用植物栽培技术的确立不仅要考察药用部位的生物产量，还要考量其药效化学成分含量，以实现药材生产的产量大、品质优的目的。从三叶青总黄酮测定结果可以看出，在生长后期，叶总黄酮含量较高，而藤茎和根总黄酮含量较低，如⑧时期，叶总黄酮含量为藤茎的5.01～6.67倍，为根的4.43～6.08倍，B和C处理可以显著提高其总黄酮含量，而B、C处理之间差异无统计学意义，说明随着光照强度的增加可以提高三叶青总黄酮的含量，但存在一个临界值；从三叶青药用部位生物量来看，随着光照强度的增加，其叶和藤茎生物量下降，根系生物量增加，促进块根的形成与发育。如图1所示，B处理中三叶青叶颜色保持绿色，根系生长旺盛，有较多块根；而C处理叶浅黄色，根系生长旺盛，须根长而多，有少量小块根。这说明适当增加光照强度可以促进三叶青根系生长与块根的形成，但光照强度过强可能损伤叶光合系统而影响植物生长。因此，综合三叶青活性成分含量和生物量，B处理可以促进三叶青黄酮类成分的合成与累积、促进块根的形成与膨大。

适度增加光照强度有利于三叶青块根的发育及总黄酮的累积，透光度20%～30%的条件较适合三叶青的栽培。