傅振远， 孟宪芳

华中科技大学同济医学院基础医学院神经生物学系，武汉 430030

微小RNA(microRNA，miRNA)是一类内源性非编码小分子RNA，可通过调控基因表达在细胞增殖、分化和凋亡等过程中发挥重要作用。microRNA-99a(miR-99a)为miRNA家族一员，研究表明，miR-99a在多种恶性肿瘤中调节与肿瘤发生发展密切相关的信号传导通路，这提示miR-99a在某些恶性肿瘤中发挥了关键作用。现就miR-99a在恶性肿瘤中作用机制的相关研究进展文献综述如下，以展望miR-99a对于恶性肿瘤的诊断、治疗以及预后的应用前景。

1 微小RNA简介

1.1 研究历史

第1个被发现的miRNA是lin-4，研究表明抑制lin-4基因可以影响秀丽隐杆线虫幼虫的发育。但lin-4基因编码的RNA并不编码蛋白质，而是产生短片段的非编码RNA。2000年研究者发现了第2个miRNA：let-7。let-7可以通过抑制lin-41与lin-28[1]基因来促进秀丽隐杆线虫的发育转变。随后，研究表明lin-4和let-7是多物种共有的一类小分子RNA。因后来发现的许多小分子RNA与lin-4和let-7 RNA有很多相似之处，于是研究人员开始使用术语“microRNA”来指代这类具有调节功能的小分子RNA。

近年来关于miRNA的研究揭示了miRNA表达具有细胞特异性与组织特异性，以及miRNA在多种生物发育过程中发挥了重要作用，并且miRNA表达水平异常与许多疾病的发生发展有密切联系，如恶性肿瘤与心血管疾病。

1.2 结构与功能

miRNA是一种在真核生物中广泛存在的RNA分子，长约20至24个核苷酸，属于非编码RNA。miRNA由DNA先转录为pri-miRNA(primary miRNA)，进而转变为pre-miRNA(即miRNA前体)，最后成为具有功能的成熟miRNA。pri-miRNA的长度大约为300～1000 nt，经过加工后成为pre-miRNA，长度大约为70～90 nt，具有特征性的茎环结构；pre-miRNA出核后经过Dicer酶剪切，成为长约20～24 nt的成熟miRNA。

成熟miRNA与Dicer酶及其他蛋白组成RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)，其中miRNA通过3′UTR与靶分子结合，发挥识别作用。RNA的沉默功能由RISC介导，其中发挥主要作用的催化亚基是Argonaute蛋白(AGO)。miRNA与AGO结合后，一条链被降解，称为乘客链(passenger strand)；另一条链与AGO组装在一起，发挥识别功能，称为引导链(guide strand)[2]。RISC对蛋白质翻译过程的抑制作用有多种机制：①在起始过程中，阻止起始复合物的组装或抑制40S核糖体亚基的募集；②抑制核糖体的组装；③中断翻译进程；④直接降解mRNA等。RISC通过抑制转录后基因表达，在调控基因表达、细胞周期、生物发育等方面起着重要作用(图1)。

图1 miRNA的生物合成与作用机制Fig.1 The biological synthesis and mechanism of miRNA

2 miR-99a与肿瘤

大量研究表明，miRNA与肿瘤发生发展关系密切[3]，按作用效应可分为致癌型(如miR-21)和抑癌型(如miR-34)。miR-99a是miRNA家族的一员，其编码基因位于21q21.1。目前已有基于TCGA等数据库的研究证实，miR-99a参与肺癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌与白血病等恶性肿瘤的发生及进展，可作为判断预后的重要指标。通过一些外源性方法提高miR-99a在恶性肿瘤中的表达可改变肿瘤的增殖、迁移和侵袭等过程，提示miR-99a对恶性肿瘤的发生发展具有重要调节作用。

2.1 miR-99a与肺癌

肺癌是一种起源于呼吸上皮细胞的恶性肿瘤，其中大多数是原发性肺癌。肺癌主要有2种类型：小细胞肺癌和非小细胞肺癌，而非小细胞肺癌又包括肺腺癌与肺鳞癌等类型。肺癌是男性中致死率最高的癌症，也是导致女性死亡的第2大常见癌症(仅次于乳腺癌)。肺癌的发病机制尚不明确，故缺乏有效的对因治疗方法。

Maemura等[4]分析了74例肺腺癌标本和相应正常样本的miRNA表达数据，结果表明与正常对照相比，miR-99a表达下调。对于miR-99a表达下调机制有多种解释，均与上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)有一定关系。

研究表明，经历EMT的癌细胞可获得某些干细胞样特性，即产生癌症干细胞(cancer stem cell，CSC)。CSC可以通过增殖和分化产生异质性癌细胞，促进肿瘤进展。但EMT的详细机制目前尚未阐明。一种观点认为：miR-99a通过直接结合靶RNA分子的3′-UTR下调E2F2(E2F transcription factor 2)和EMR2(EGF-like module-containing，mucin-like，hormone receptor-like 2)表达量，导致细胞周期停滞与细胞凋亡，从而抑制上皮细胞的EMT过程；同时也降低了CSC的数量，并抑制CSC的干细胞特征与恶性程度[5]。另一种解释认为，miR-99a通过抑制胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF-1R)表达来抑制EMT过程[6]。由于过表达miR-99a下调IGF-1R和通过siRNA降低IGF-1R表达对肿瘤细胞表型产生了相似的影响(如抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭)，表明miR-99a的抑癌作用与IGF-1R有关。

另有研究表明，miR-99a通过靶向NADPH氧化酶4(NADPH oxidase 4，NOX4)介导的ROS生成通路来抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移[7]。在肿瘤转移前，NOX4表达量增加可加速肺癌病程进展。其机制可能为NOX4通过正反馈调节PI3K/AKT信号通路来促进非小细胞肺癌细胞增殖和转移，而PI3K/AKT信号通路也可通过NF-κB信号通路来正调控NOX4表达量[8]。其他研究发现，恢复AKT1正常表达可部分消除miR-99a对非小细胞肺癌细胞侵袭的抑制作用，表明miR-99a介导的肿瘤抑制作用与调节AKT1表达有关[9]。

2.2 miR-99a与膀胱癌

膀胱癌是一种发生于膀胱组织中的恶性肿瘤，是我国目前发病率最高的泌尿系统恶性肿瘤(欧美则为前列腺癌)。膀胱癌最常见的病理类型是移行细胞癌，其他类型则包括鳞状细胞癌和腺癌等。引起膀胱癌的危险因素众多，但具体发病机制尚不明确，故目前治疗仍以手术为主。

Li等[10]通过分析GEO和TCGA等数据库，发现miR-99a的表达水平在膀胱癌中低于正常对照。在膀胱癌组织中PI3K/AKT/mTOR信号通路通常呈激活状态，目前作为膀胱癌治疗的潜在靶点[11]。另有研究通过生物信息学分析证实膀胱癌组织中多种异常表达的miRNA与PI3K信号通路、胰岛素/IGF信号通路和FGF信号通路均密切相关[12]，故miR-99a在膀胱癌诊断与治疗中有重要的应用价值。

现有研究证实，miR-99a通过靶向膀胱癌细胞膜上的生长因子受体3(fibroblast growth factor receptor 3，FGFR3)与mTOR(mammalian target of rapamycin)来抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭。荧光素酶测定结果表明，在miR-99a-5p转染的细胞中miR-99a-5p直接结合至mTOR的3′-UTR，抑制mTOR mRNA和蛋白质产物的表达，并且过表达miR-99a-5p可通过靶向mTOR核心蛋白进而对mTORC1和mTORC2产生双重抑制作用[13]。另有研究通过向膀胱癌细胞系中转染miRNA-99a后，测定了细胞活性、细胞迁移相关指标，证实miR-99a可通过靶向膀胱癌细胞表面的FGFR3来抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭[14]，这些结果表明miRNA-99a可以通过调节mTOR与FGFR3来调控膀胱癌的发生发展。

2.3 miR-99a与乳腺癌

乳腺癌是一种发生于乳腺组织中的恶性肿瘤，是女性最常见的恶性肿瘤之一。乳腺癌有2种常见类型：起源于导管上皮细胞的恶性肿瘤被称为导管癌；起源于乳腺小叶细胞的恶性肿瘤被称为小叶癌。乳腺癌的病因目前尚不清楚，可能与雌激素水平、环境因素与生活方式等有关。

Adhami等[15]比较了乳腺癌和正常组织之间的miRNA表达水平差异，发现在乳腺癌中miR-99a表达水平低于正常对照。Hu等[16]测定了多种乳腺癌细胞系与10名乳腺癌患者肿瘤标本中miR-99a的表达水平，也发现miR-99a表达水平显著下调。通过进一步研究，他们认为作用机制可能是miR-99a表达水平下调升高了mTOR及其下游磷酸化蛋白(包括p-4E-BP1和p-S6K1)的表达量，因为恢复miR-99a正常表达可抑制mTOR信号通路及其下游磷酸化蛋白表达。

另有研究认为IGF-1R与HOXA1(homeobox A1)mRNA是miR-99a作用的直接靶标。Wang等[17]发现在乳腺癌组织中HOXA1的表达量显著升高，同时敲除HOXA1可显著抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，故HOXA1可能是一个受到miRNA抑制的癌基因。进一步研究证实miR-99a可直接与HOXA1 mRNA的3′UTR结合，而且恢复HOXA1表达可部分逆转miR-99a对乳腺癌细胞的抑制作用，这些结果表明HOXA1是miR-99a的直接作用靶点。与之类似，Xia等[18]发现通过siRNA降低内源性IGF-1R表达可产生与过表达miR-99a相似的作用，从而证实IGF-1R是miR-99a在乳腺癌中的作用靶点。

2.4 miR-99a与肝癌

肝癌是发生于肝脏的恶性肿瘤，其中最常见的类型是肝细胞癌。造成肝癌的主要病因为乙型肝炎、丙型肝炎或醇类物质所导致的肝硬化。其他病因则包括黄曲霉素、非酒精性脂肪肝和肝吸虫等。我国肝癌患者最常见的病因是乙型肝炎病毒感染，而在欧美等发达地区醇类物质所导致的肝硬化与丙型肝炎病毒感染是更为常见的病因[19]。然而这些病因导致肝癌发生的具体机制目前仍未研究透彻。

Li等[20]通过对Illumina Solexa测序进行分析，发现miR-99a的表达水平在肝癌中低于相应的正常对照。由于miR-99a表达水平的降低程度与肝癌患者的生存率呈负相关，故miR-99a可作为肝癌患者预后的评价指标。Li等同时发现在体外恢复miR-99a正常表达可显著抑制肝癌细胞的生长繁殖，而且瘤内注射miR-99a mimics可抑制肿瘤生长并降低携带肝癌的裸鼠体内甲胎蛋白水平。通过进一步研究，他们认为可能的机制是miR-99a可诱导肝癌细胞产生G1期停滞。

最近大量研究表明PI3K/AKT/mTOR信号通路及其下游的转录因子是新型肝癌标志物[21]。Li等[20]发现肝癌组织中的miR-99a表达量与IGF-1R和mTOR的表达水平呈负相关。进一步研究发现miR-99a mimics可抑制IGF-1R和mTOR信号通路，进而抑制细胞周期相关蛋白的表达，如细胞周期蛋白D1。这可能是miR-99a对肝癌抑制作用的机制之一。另有研究发现在体外应用IGF-1(IGF-1R的配体)或MHY1485(mTOR激动剂)可逆转miR-99a抑制肿瘤生长的作用，表明IGF-1R和mTOR是miR-99a在肝癌中的直接靶标[22]。

2.5 miR-99a与白血病

白血病是一类骨髓造血干细胞异常增殖并产生大量异常白细胞的恶性克隆性疾病，是儿童中最常见的恶性肿瘤。这些尚未分化成熟的白细胞被称为白血病细胞。白血病主要有4种类型：急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)、急性髓性白血病(acute myelogenous leukemia，AML)、慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)和慢性髓性白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)。白血病的病因尚不清楚，可能与感染、接触某些物理或化学因素有关。

Cheng等[23]分析了74名AML患者的miR-99a表达报告，发现在AML与CML中miR-99a表达水平增高与不良预后显著相关。进一步对其机制进行研究发现miR-99a可以靶向两种抑癌基因：CTDSPL(CTD small phosphatase like)和TRIB2(tribbles pseudokinase 2)[24]，故miR-99a表达水平上调可加速AML与CML的进展。

与AML和CML相反，miR-99a表达在多数ALL患者中呈抑制状态[25]。作用机制可能为miR-99a可抑制FKBP51(FK506-binding protein 51)表达，而FKBP51可抑制白血病细胞凋亡，是肿瘤靶向治疗的潜在靶点。ALL患者中miR-99a表达下调导致FKBP51表达水平升高，可进一步抑制糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor，GR)的活性。故在ALL细胞中恢复miR-100和miR-99a表达水平可抑制白血病细胞增殖并增加地塞米松诱导的细胞凋亡。另一种作用机制可能为miR-99a过表达可抑制IGF-1R/mTOR信号通路及其下游癌基因Mcl-1表达，故表现出抑癌作用。Mcl-1是Bcl-2蛋白家族中的一种癌基因，在许多癌症中高度扩增，可导致肿瘤细胞异常增殖和细胞凋亡逃逸，也是白血病靶向治疗的潜在靶点。

白血病细胞对化疗药物产生耐药是白血病治疗的一大难题，研究发现miR-99a异常表达可上调下游靶基因(如E2F和Myc)和部分在白血病干细胞(Leukemia stem cell，LSC)细胞周期中发挥重要作用的基因的表达，导致白血病细胞暴露于化疗药物后，集落形成能力和增殖能力增强，还有部分原因是由于miR-99a表达水平升高可导致白血病细胞对化疗药物诱导的细胞周期停滞产生抵抗(如长春新碱和柔红霉素[26-27])。同时该研究表明，miR-99a可作为监测白血病病程进展的生物标志物[28]。

2.6 其他癌症

已有多篇文献报道miR-99a在人类恶性肿瘤中呈现低水平表达，如前列腺癌、口腔鳞癌、头颈部鳞癌、食管鳞状细胞癌、宫颈癌、卵巢癌、Kaposi肉瘤等恶性肿瘤[29-33]。这意味着miR-99a是一个潜在的肿瘤抑制因子。然而，miR-99a并非在所有恶性肿瘤中都呈现低表达水平，有研究显示miR-99a可能在某些恶性肿瘤中(如胃癌、肾癌、结肠癌)表达水平升高，起着致癌因子的作用[34-37]。miR-99a在恶性肿瘤中的作用机制研究进展汇总见图2。

图2 miR-99a在恶性肿瘤中作用机制的研究进展Fig.2 The research progress of the action mechanism of miR-99a in malignant tumor

3 展望

miR-99a与肺癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌和白血病等癌症的发生发展密切相关，其异常表达提示miR-99a是多种恶性肿瘤的潜在治疗靶点，并且在恶性肿瘤的早期诊断、肿瘤分期分级与预后判断等方面也有一定的价值。然而，miR-99a及其相关信号通路在恶性肿瘤中的作用机制尚未完全明确，进一步研究其作用机制对miR-99a成为恶性肿瘤治疗的新靶点具有重要的意义。