王 娟，安家兴，庹必光

遵义医科大学附属医院消化内科 贵州遵义 563000

脱氧核糖核酸酶(DNase)是特异性靶向DNA的核酸内切酶。DNase中发挥主要作用的是DNase1家族，其主要功能为降解体内异常的DNA。DNase1家族属于Tat D蛋白家族，现有DNase1、DNase1L1、DNase1L2和DNase1L3共4个成员，成员之间具有很高的序列同源性，但表达部位却有很大差异[1]。DNase1是该家族最先被发现的成员，有助于清除循环中游离的DNA。缺乏DNase1时，血清中DNA/染色质复合物将会持续存在，导致自身抗体的形成。DNase1在系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)、类风湿关节炎、干燥综合征、甲状腺自身免疫性疾病和炎症性肠病患者的血清中活性降低[2-4]，是许多自身免疫性疾病(尤其是SLE)的危险因素[5-7]。DNase1是肾小管上皮细胞中消化DNA的主要核酸酶[8]，其功能障碍会导致严重的狼疮性肾炎[9]。Dnase1已被证明可以成功地消化囊性纤维化中的游离DNA，可以清除黏液，达到治疗目的[10]。

肝脏是体内一线免疫组织，每分钟体内血液总量的30%会流经肝脏[11]。因此，血液循环中积累的DNA片段可以引起与肝脏相关的免疫反应，从而导致一系列肝脏疾病。Ludwig等[12]的研究表明肝脏是血清DNase1的来源之一，DNase1可能在阻止一些肝脏疾病的进展方面发挥重要作用。本综述旨在阐明DNase1的结构和功能，阐明其在肝病发病机制中的作用，从而为该类疾病的诊断和治疗提供更多选择。

1 DNase1的结构和功能

DNase1是一种由283个氨基酸组成的核酸内切酶，相对分子质量为31 434。该基因位于16p13.3号染色体上，包含9个外显子和8个内含子，这些内含子跨越15 kb基因组DNA[13]。DNase1包含一个特征性的 DNase结构域。DNase结构域是构成DNase1超家族(一种由重复突变产生的祖先基因)的基础[14]。DNase1超家族通常作为磷酸水解酶来裂解DNA的磷酸二酯键[15]。DNase结构域高度保守，其中257个氨基酸残基分散在整个一级序列中[16]，这些残基也高度保守。Dlaklc[17]的研究表明这些保守的氨基酸残基可能对催化作用更为重要。例如，His131是组氨酸残基，可能是与DNA双链的磷酸盐发生静电相互作用的位点[18]。但是在现阶段，仍不清楚DNA在何处以及如何与酶结合。结构域包含四层α/β三明治基序[19]，可以形成三个疏水核，而这个疏水区域主要负责DNase1的结构稳定性和刚性。保证酶稳定性的其他因素包括分子内氢键、盐桥、两个二硫键(其中半胱氨酸170至206这一片段对活性至关重要)和两个Ca2+结合位点[20]。Ca2+结合位点的存在可保护DNase1不被蛋白酶水解，防止半胱氨酸 170和206之间二硫键的还原[21]，参与还原酶的重新折叠[22]，稳定分子中的环区。DNase1活性取决于二价阳离子的存在，没有二价阳离子时甚至无法检测到DNase1活性，但是Zn2+和二价阳离子的螯合剂除外，它们会抑制DNase1活性[23]。还有一些情况也会使DNase1活性下降：与单体G肌动蛋白结合几乎可以完全抑制DNase1的活性[24]；在高于80 ℃时，DNase1活性会完全丧失[25]；在pH4.5以下或pH9.5以上环境中DNase1也会丧失活性[26]。DNase1在DNase结构域之前包含一个长度为18～22个氨基酸的信号序列(N端信号肽)，该序列的功能是抑制DNase1活性[27]，并促进内质网转运[1]。

DNase1是一种分泌蛋白，当N端信号肽被酶切后，成熟的DNase1将被转运至核膜并保存在酶原颗粒中[1]。当细胞暴露于某些刺激时，DNase1从核膜中释放出来并分泌到细胞外，参与坏死细胞的染色质分解。有两个机制可阻止DNase1进入细胞核，以避免DNase1破坏正常核酸。一个是DNase1的N端信号肽可引导DNase1蛋白分泌至细胞外，或将其限制在内质网、高尔基体或核膜中[28]。第二个是DNase1缺乏核定位信号，因此其无法被跨核膜转运蛋白转运[29]。在细胞内(包括高尔基体和内质网等细胞器)和细胞外均可检测到DNase1[1]。由于DNase1会与胞质溶胶中G肌动蛋白形成复合体，特异性抑制DNase1活性[30]，因此DNase1在细胞内不发挥作用。

DNase1以Ca2+/Mg2+依赖性方式优先切割双链DNA，产生3’-OH/5’-P末端[26]。DNase1会优先切割“裸”DNA(无蛋白质的DNA)，尤其是小于150 bp的短基因片段，但是只能在体内蛋白水解酶的帮助下切割染色质。除此之外，DNase1倾向于将5’端切成T末端片段[31]。具体而言，在早期阶段，DNase1会按照dT-dN、dN-dA和dG-dN的顺序攻击磷酸二酯键，但很少攻击dC-dN键。在降解的后期，尽管在5’端对dA的偏好仍然存在，但在3’端对dT的偏好消失[25]。

2 人体内DNase1的来源和分布

人胰腺中负责外分泌的胰岛细胞[32]和胃肠道中的杯状细胞[33]可以分泌DNase1到消化道中，并且胰腺来源的DNase1活性最高[34]，所以最初DNase1被认为只是一种消化酶。DNase1在酸性环境中活性会降低甚至失活,关于DNase1如何在胃中被保存并发挥作用，目前人们提出了两种假说[34]：第一种认为DNase1在经过胃的时候通过将它的原始结构改变成胃酸不能分解的形式而被保存下来；另一种认为DNase1通过翻译后糖基化而获得酸稳定性。Wroblewski等[35]在1950年报道DNase1也存在于人的血液中，血液中的DNase1通过核孔被动扩散或直接通过受损的核膜到达受损细胞，从而发挥降解DNA的功能[36]。Napirei等[37]指出血液中的DNase1主要由肝脏、甲状腺、脑垂体和消化道(胃、十二指肠、小肠和大肠)分泌。泌尿生殖系统(肾脏、膀胱、附睾、腹侧前列腺、副腺和卵巢)和内分泌组织(如甲状腺和垂体)也会分泌DNase1[24,38-40]，并且在泪腺、眼和肠系膜淋巴结中也检测到了DNase1[37]。有研究[41]表明DNase1活性调控受到雄激素的影响，所以男性泌尿系统和肝脏中DNase1活性明显高于女性。

3 DNase1与肝脏疾病

到目前为止，肝脏已被证实为是血清中DNase1的来源之一，并且肝脏DNase1活性和血清DNase1活性存在平行关系[12]。在正常情况下DNase1不能进入细胞核，因此DNase1在肝脏和血液中均不发挥作用。但当肝脏发生炎症或坏死时，肝细胞破裂并释放出DNase1，肝脏和血清DNase1活性均升高。而增多的DNase1在清除坏死肝细胞染色质过程中发挥了重要作用，从而缓解或避免一系列由肝细胞坏死引起的肝脏疾病。目前虽然肝脏疾病与DNase1的关系还未研究透彻，但是多项研究[42-44]显示DNase1活性会随着肝脏疾病的进展而变化，提示DNase1有可能成为肝脏疾病诊断及预后判断的生物指标。DNase1是体内分解循环中多余DNA的酶之一，在疾病发展期间或许可以通过人为调节DNase1活性从而达到治疗疾病的目的。

3.1肝癌肝癌是癌症相关第二大死亡原因[45]，其中肝细胞癌占肝癌的95%。癌栓是导致癌症患者非肿瘤死亡的主要原因，而中性粒细胞外陷阱(neutrophil extracellular trap,NET)是导致肝癌血栓形成的重要因素之一。NET是在病原微生物入侵机体时由中性粒细胞释放的染色质和各种酶原颗粒形成的网状结构[46]。NET可以与红细胞结合并充当血栓形成的支架[47]，影响组织血供从而损害细胞[48]，具有促炎和血栓形成的作用。血清中的DNase1可消化NET的DNA骨架，从而减少癌栓的形成[48]。循环游离DNA(cf-DNA)是存在于人体血液、尿液和其他体液中的游离DNA，由极短(<200 bp)的双链DNA片段组成[49]。带负电荷的cf-DNA会形成空间位阻，因此细胞外基质中高水平的cf-DNA可能会阻碍癌症患者化疗药物的分布并降低药物疗效[50]。长度为147 bp的cf-DNA已被证实为核小体[49]。核小体是细胞死亡的副产物，具有高增殖指数的浸润性肿瘤患者体内核小体释放增多。DNase1可以降解cf-DNA，降低血浆核小体水平。研究[51]表明，肝细胞癌组织中核酸内切酶活性明显低于正常肝组织，并且NET和cf-DNA浓度显著增加。因此DNase1或可成为肝细胞癌化疗反应的预测因素和预后生物标志物[52]。然而，重组DNase1是否能用于肝细胞癌的治疗还需要研究证实。

3.2自身免疫性肝病自身免疫性肝病是一种由于人体免疫系统异常导致正常肝脏细胞受到攻击的疾病。自身免疫性肝病是指包括原发性胆汁性肝硬化、自身免疫性肝炎和原发性硬化性胆管炎在内的一系列疾病。这些肝脏疾病的病因尚不清楚，并且在临床治疗中也存在许多困难[43]。DNase1是人体组织和血清中存在的一种核酸内切酶，其缺乏可能导致坏死性物质清除不良，在炎症和免疫耐受丧失中起重要作用。细胞异常死亡时由于DNA片段未能被及时清除，导致DNA片段通过循环到达肝脏，进而触发DNA驱动的自身免疫反应[53]。Gatselis等[43]研究发现上述3种自身免疫性肝病患者血清DNase1活性显著低于正常人，但这3组患者血清DNase1活性无明显差异。DNase1活性与原发性胆汁性肝硬化和自身免疫性肝炎的发病有关，而血清DNase1活性升高可能是自身免疫性肝炎完全缓解的独立预测因子[43]。通过调节DNase1活性治疗自身免疫性肝病可能是一个新的研究方向。

3.3药物性肝损伤药物性肝损伤病死率很高，也是临床上急性肝功能衰竭的主要原因之一[54]。对乙酰氨基酚是一种广泛使用的镇痛药，其过量使用可导致药物性肝损伤[55]。肝脏受到毒性药物刺激后，储存在肝细胞以及肝窦内皮细胞核和线粒体中的DNA被释放到细胞质中[44]。药物再诱导细胞质中的DNA以一种不依赖于坏死的机制从肝细胞释放到肝窦微血管中，通过血液循环，在肝微循环和肝实质中沉积[56]。细胞外沉积的DNA可导致肝细胞坏死以及无菌性炎症的发生[44]。肝损伤早期出现代谢障碍会阻碍DNase1的生成，从而促进肝脏DNA的沉积。研究[44,57]表明，对乙酰氨基酚中毒后，DNase1可切割细胞外DNA，显著抑制对乙酰氨基酚介导的肝脏炎症和损伤。而对乙酰氨基酚给药后血清DNase1活性会逐渐增加[57]。因此，对细胞外DNase1的识别管理可能是治疗药物诱发的肝损伤的关键手段之一。

3.4乙型肝炎乙型肝炎是一种常见的疾病，由于基因组HBV病毒库的持续存在，如游离型共价闭合环状DNA和染色体整合的HBV DNA，患者在停药后经常会复发，这给乙型肝炎的治疗带来了很大的困难。研究[58]发现DNase1存在于HBV感染者血清的HBV颗粒中；在感染早期，HBV颗粒中存在的DNase1有助于降解循环中的HBV DNA颗粒，这也是感染早期HBV DNA颗粒复制较少的原因；随着病程进展到肝硬化、肝癌阶段时，DNase1的表达明显上调，并且可以抑制HBV的复制。最近，Hallez等[42]发现DNase1可以与细胞内HBc簇结合，从而进入到新生的HBV衣壳中并降解HBV DNA，或可降低复发率，这为乙型肝炎的治疗提供了新思路。

4 展望

DNase1是一种核酸内切酶，主要功能是降解人体内细胞死亡时释放的DNA。DNase1中起主要作用的部位是DNase结构域，该结构域上的保守残基通过催化作用影响核酸内切酶的活性。肝脏是DNase1的主要来源。目前发现DNase1与4种肝脏疾病有关：肝癌、自身免疫性肝病、药物性肝损伤和乙型肝炎。已有大量研究证实在肝脏疾病的发生发展过程中，DNase1发挥了阻止疾病进展的积极作用。但是目前关于DNase1的研究主要集中在其与自身免疫性疾病的关系，而关于DNase1在肝脏疾病发病机制中具体作用的研究还太少。进一步探索DNase1与肝脏疾病发生发展的关系，可为相关肝脏疾病提供新的生物标志物和治疗靶点。