姚蓉 陆宇

反复不规范、不合理使用抗结核药物及结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)耐药性的产生，给结核病的治疗带来了困难和挑战；研发活性更高、疗程更短的抗结核新药及药品组合是解决此问题的关键。早期杀菌活性(early bactericidal activity，EBA)的测定是临床评价抗结核新药活性的第一步[1]。EBA通常定义为抗结核治疗最初2 d 内，每日每毫升痰液中活菌数[菌落形成单位(colony forming unit，CFU)]平均下降速率的对数值。最早关于EBA的研究开展于20世纪80年代的肯尼亚，研究发现治疗各组肺结核患者痰活菌计数的下降速率在治疗的前2 d最快，各组平均杀菌速率差异有统计学意义；在随后的2～14 d中，各组平均杀菌速率平稳下降，差异无统计学意义[2]。测定EBA是临床评价抗结核药物的初始步骤，其对了解抗结核新药的作用和特性具有重大贡献。笔者拟从EBA研究的临床意义、EBA研究的方法、主要抗结核药品的EBA研究进展进行概括，旨在辅助临床医生选择合适的抗结核药品或药品组合方案，尤其是耐多药结核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)和广泛耐药结核病(extensively drug-resistant tuberculosis，XDR-TB)的治疗，并为抗结核新药的研发提供帮助。

一、 EBA研究的临床意义

EBA被美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于抗结核药物Ⅱa期临床试验的疗效评价，是快速、准确评估药物是否具有抗结核活性和探索其安全性的方法，可指导后续研究的剂量选择。同时，通过测定一种抗结核药品在不同剂量下的EBA可估算该药品的治疗范围[3]。除了证明一种药物是否具有杀菌活性外，EBA研究还可以用来量化这种杀菌活性的程度。虽然单药疗法被认为可能会增加出现耐药性的风险，但在EBA研究的过程中并没有发生过上述情况[2],推测EBA可能在某种程度上反映该药物防止其他药物产生耐药菌的能力。EBA的大小能反映药物进入肺部结核病灶的能力。因为一种药物要具有杀菌活性，首先得进入相应的肺组织才能发挥杀菌作用，而杀菌能力的大小则与抗结核药物穿透组织能力密切相关。此外，评估新型抗结核药物和方案的传统疗效试验成本昂贵，需要2～4年时间才能完成，但EBA可以大大减少评估治疗效果所需的时间。综上所述，EBA研究对于抗结核新药能否进入临床应用具有重要的意义。

二、 EBA研究的方法

(一) 患者纳入和排除标准

一般来讲，纳入事先没有接受化疗的显微镜下痰涂片阳性的肺结核患者，且能够产生足够数量的隔夜痰(至少10 ml)，其年龄在18～60岁之间，体质量超过40 kg，并同意进行HIV血清学检查者。排除怀疑有粟粒病灶或结核性脑膜炎的患者，以及过去6个月内接受过抗结核治疗的患者，或者有糖尿病等慢性疾病共病和心电图Q-T间期异常的患者[4]。

(二)痰标本的收集和处理

化疗开始前2 d连续12～16 h用宽口痰罐收集痰液，然后在治疗期间从20时至8时收集痰标本，收集后尽快送实验室处理。不能立即送至实验室的标本应冰冻保存，并于48 h内送至实验室。标本送至实验室后，首先测量痰液体积，通过磁搅拌使标本均匀化30 min。将最大体积为10 ml的样品加入0.1%二硫苏糖醇等体积中，混匀，静置20 min，得到消化后的痰液供进一步处理。由于痰标本在采集过程中通过口咽，培养污染限制了结核病痰培养的诊断率，故标本去污是一个重要的步骤。常规去污方法存在以下缺点：杀死许多MTB，程序昂贵和耗时，多个处理步骤增加了标本交叉污染和传染实验室工作人员的风险。而N-乙酰-L-半胱氨酸-氢氧化钠(NALC-NaOH)处理方法可以在不影响分离率和不增加污染率的情况下快速有效地减少污染微生物的数量[5]。在室温下，分别加入等体积的NALC和低浓度NaOH进行液化消毒15 min；去污后，所有的标本都用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS；pH=6.8)进行中和，以4000×g离心15 min。离心后获得的沉淀物再悬浮于2 ml的PBS中，用于涂片和接种到培养基进行培养。有研究比较了5 h和12 h内收集的痰标本中细菌负荷的变异性，发现其CFU计数或变异性没有明显差异[6]。这一发现表明，收集时间的减少不会影响痰标本的细菌载量。Nasci-mento 等[6]研究发现，样品质量和实验室程序变化引起的患者间和细胞内变化，如痰液不完全均匀、痰中唾液过多、稀释和菌落计数错误等因素会影响标本中的细菌载量。

(三)在固体培养基上进行CFU计数

将10倍梯度稀释痰液接种于含两性霉素、多粘菌素B、羧苄青霉素及三甲氧苄氨嘧啶的Middlebrook 7H10琼脂平板培养基上[4]，37 ℃，5%～10% CO2的培养箱内培育3～4周。每周观测培养板，在可产生10～50个可见菌落稀释度的平板上计数菌落。先计数基线值(未开始用药前)对应的log10CFU，再计数用药之后第n天的log10CFU，EBA值用未稀释痰液log10CFU·ml-1·d-1来表示，然后根据公式：log CFU/ml(第0天)-logCFU/ml(第n天)/n，计算每例患者的EBA。

(四)在液体培养基上测定确定阳性时间(time to positivity，TTP)

在EBA研究中，在液体培养基中培养和测定TTP具有更大的敏感性，并且检测速度更快，且TTP的测定具有高度标准化的优点，可在实验过程中减少人为误差，所以是CFU计数定量MTB的有效的替代方法[7]。TTP测定方法：将标本在BACTEC MGIT 960中培养，2.5 ml均质化痰标本用1.5%的NaOH在室温下消毒15 min，用PBS进行中和，以3000×g离心15 min。丢弃上清液后，将沉积物与PBS重新悬浮至2.5 ml，并将0.5 ml接种到MGIT管中[8]。在MGIT管中加入OADC增菌剂和含有多粘菌素B(6000 U)、甲氧苄啶(600 μg)、两性霉素B(600 μg)、阿洛西林(600 μg)和纳利昔酸(2400 μg)的杂菌抑制剂及0.5 ml的再悬浮颗粒，于37 ℃ 下孵育，系统自动标记阳性培养物，以小时为单位对TTP进行记录[9]。

三、主要抗结核药品的EBA研究

(一)一线抗结核药品

1.异烟肼(isoniazid，INH)：INH是抗结核治疗方案的重要组成药品，可有效对抗快速分裂的MTB。INH的EBA呈现剂量相关性[10-11]。其在抗结核药品中对MTB杀菌活性最高，300 mg INH所对应的0～2 d的EBA为0.722 log10CFU·ml-1·d-1；且任何含有INH的方案，无论是单独或与1或2种药品联合使用，都具有更高的EBA[2]。

2.利福平(rifampicin，RFP)：RFP是一种利福霉素类半合成广谱抗菌药，其EBA明显低于INH[2]。研究显示，RFP的EBA随着药品剂量的增加而增加，150 mg RFP的0～2 d 的EBA为0.071 log10CFU·ml-1·d-1，而600 mg RFP的0～2 d 的EBA为0.293 log10CFU·ml-1·d-1[12]。Diacon等[13]和Boeree等[14]的实验均证明了高剂量的RFP可以使痰液中MTB载量下降更多，且安全性和耐受性良好。

3.吡嗪酰胺(pyrazinamide，PZA)：PZA在结核病短程化疗方案中起着至关重要的作用。Jindani等[2]研究显示，PZA单药对第0天至第2天痰培养菌落数下降的影响不大，EBA为0.44 log10CFU·ml-1·d-1。

4.乙胺丁醇(ethambutol，EMB)：Jindani等[2]的实验显示，EMB单药 0～2 d的EBA为0.246 log10CFU·ml-1·d-1，Botha等[15]的实验结果为EMB的平均EBA低于(0.245±0.046) log10CFU·ml-1·d-1，其没有灭菌活性，只对防止耐药性的出现有价值，而对缩短治疗时间无价值。

5.链霉素(streptomycin，Sm)：Sm可能是所有抗结核药物中在体外具有最积极杀菌作用的药品。开普敦的一项研究证实了氨基糖苷类抗生素的低EBA特性[16]。另一项研究显示，Sm的0～2 d的EBA为0.094 log10CFU·ml-1·d-1，2～14 d的EBA为0.130 log10CFU·ml-1·d-1，差异无统计学意义。因此，Sm在治疗前2 d的低EBA似乎不是延迟杀菌作用的结果[2]。

(二)二线抗结核药品

1.氟喹诺酮类药物(fluoroquinolones，FQ)：FQ具有较强的杀灭MTB的作用，已成为临床治疗耐药肺结核的首选。Johnson等[17]研究显示，INH的0～2 d的EBA(0.67 log10CFU·ml-1·d-1)大于莫西沙星(0.33 log10CFU·ml-1·d-1)和加替沙星(0.35 log10CFU·ml-1·d-1)，而高剂量左氧氟沙星(1000 mg)对应的EBA 为0.45 log10CFU·ml-1·d-1；所有3种FQ 2～7 d的EBA相似，且大于INH。Pletz等[18]研究显示，INH和莫西沙星0～5 d的EBA分别为0.209 log10CFU·ml-1·d-1和0.273 log10CFU·ml-1·d-1，差异无统计学意义。Sirgel等[19]研究显示，250 mg、500 mg、1000 mg 和1500 mg环丙沙星对应的0～2 d的EBA从无药组的-0.011 log10CFU·ml-1·d-1分别增加到0.046 log10CFU·ml-1·d-1、0.092 log10CFU·ml-1·d-1、0.121 log10CFU·ml-1·d-1和0.205 log10CFU·ml-1·d-1，这些结果显示出高剂量环丙沙星的显著杀菌活性。

2.利奈唑胺(linezolid，Lzd)：Lzd属于噁唑烷酮类抗生素，具有优异的体外和体内抗结核活性。Dietze等[20]为了评价Lzd在肺结核患者中的早期和延长EBA，让患者接受7 d 的300 mg INH每日1次或600 mg Lzd每日2次或600 mg Lzd每日1次治疗，结果显示，3个研究组的0～2 d的EBA差异有统计学意义，INH的0～2 d的EBA (0.67 log10CFU·ml-1·d-1)大于每日1次和每日2次Lzd(分别为0.26 log10CFU·ml-1·d-1和0.18 log10CFU·ml-1·d-1)；另外，利奈唑类药物的2～7 d的EBA最小。

3.氯法齐明(clofazimine，Cfz)：Ammerman等[21]系统地评估了Cfz在体外和体内的EBA，结果显示，无论是体外或体内，任何浓度下的Cfz在第1周都没有表现出杀菌活性；然而，在第2周，Cfz在体外表现出浓度依赖性的抗菌活性，在体内观察到有限的抗菌活性。这表明Cfz的延迟EBA可能更多的是由于其作用机制，而不是宿主相关因素。

4.阿米卡星(amikacin，Am)：Donald等[22]研究显示，5 mg/kg、10 mg/kg和15 mg/kg的Am对应的0～2 d的EBA 为0.041 log10CFU·ml-1·d-1、0.045 log10CFU·ml-1·d-1和0.052 log10CFU·ml-1·d-1，未接受药物组的EBA为0.041 log10CFU·ml-1·d-1，给药组与无药组的EBA差异无统计学意义。另一项研究检测了7例新诊断的涂片阳性肺结核患者用脂质型Am治疗的EBA，结果显示，尽管Am的浓度很高，但一直无法检测到任何EBA，表明Am未能从其脂质体中释放出来[23]。虽然Am杀菌作用可能比其他药物要低，但其可用于出现预防耐药性。Am和所有氨基糖苷类药物的低EBA，可能是由于酸性微环境，限制了其化疗早期的杀菌活性。

5.对氨基水杨酸(p-aminosalicylic acid，PAS)：PAS的EBA仅在4例患者中进行过评价，其0～2 d的EBA为0.259 log10CFU·ml-1·d-1，但其2～14 d的EBA较低，只有0.076 log10CFU·ml-1·d-1[2]。与其他单一药物方案相比，其表现出的杀菌作用较弱。

6.利福布汀(rifabutin，Rfb)：Chan等[12]研究显示，服用300 mg和600 mg Rfb的患者0～2 d的EBA 分别为0.014 log10CFU·ml-1·d-1和0.075 log10CFU·ml-1·d-1，计数变化小，不会随剂量的增加而增加。

7.利福喷丁(rifapentine，Rft)：Sirgel等[24]将Rft分为600 mg、900 mg、1200 mg等3个剂量组，其EBA与剂量大小的相关性很小，0～2 d的EBA和2～5 d的EBA分别为0.257 log10CFU·ml-1·d-1和0.194 log10CFU·ml-1·d-1，差异有统计学意义。

(三)新型抗结核药物

1.贝达喹啉(bedaquiline，Bdq，TMC207)：Bdq是一种二芳基喹啉类药品，是过去40多年来美国FDA批准用于治疗耐药结核病的第一种药品[25]。Rustomjee等[26]测定了Bdq治疗0～7 d的EBA，其将Bdq分为3个剂量组，分别是25 mg、100 mg和400 mg，并与300 mg INH和600 mg RFP进行了比较，结果显示，各剂量组0～7 d的EBA分别为(0.04±0.46) log10CFU·ml-1·d-1、(0.26±0.64) log10CFU·ml-1·d-1、(0.77±0.58) log10CFU·ml-1·d-1；虽然Bdq在治疗的最初几天没有显示出明显的反应，但从第4天起，观察到400 mg Bdq的显著杀菌活性，说明Bdq具有延迟杀菌活性。同时，可以发现，在治疗4～7 d，400 mg Bdq每天的CFU下降幅度与同期的INH和RFP相似。此外，Bdq的耐受性好，没有研究药物相关的严重不良事件发生。在南非进行的一项研究显示，Bdq治疗14 d的EBA为0.061 log10CFU·ml-1·d-1[27]。另一项研究评估了每日100 mg、200 mg、300 mg和400 mg Bdq治疗14 d的EBA，分别在第1个治疗日加药200 mg、400 mg、500 mg和700 mg，第2个治疗日加药100 mg、300 mg、400 mg和500 mg，以使Bdq血浆水平迅速达到所需的目标浓度。这四组Bdq治疗14 d的EBA分别为0.040 log10CFU·ml-1·d-1、0.056 log10CFU·ml-1·d-1、0.077 log10CFU·ml-1·d-1和0.104 log10CFU·ml-1·d-1，所有的Bdq组均表现出明显的杀菌活性，抗菌作用随着剂量的增加而升高[28]。

2.德拉马尼(delamanid，Dlm，OPC-67683)：Dlm是继Bdq之后，由日本大冢制药研发的第2种抗结核新药[29]。在南非进行的一项为期14 d的 EBA研究显示，Dlm分为100 mg、200 mg、300 mg和400 mg等4个剂量组；结果显示，尽管4个治疗组的EBA差异无统计学意义，但与接受100 mg 和400 mg Dlm治疗组相比，接受200 mg和300 mg Dlm治疗组有更多患者在14 d内经历了0.9 log10CFU·ml-1·d-1痰菌载量下降的反应，表明Dlm具有显著的连续杀菌活性，但其杀菌活性无剂量依赖性[30]。Saliu等[31]研究发现，Dlm的灭菌率表现出浓度依赖性，在最高剂量水平(1.0 mg/ml)下，优于INH，接近或等同于RFP。

3.PA-824(pretomanid)：PA-824是一种硝基咪唑类化合物，抑制MTB蛋白质和细胞壁脂质的合成。Diacon等[32]针对PA-824做了两项研究，第一项研究将PA-824分成200 mg、600 mg、1000 mg和1200 mg等4个剂量组，结果表明，TTP测定的PA-824活性与痰菌CFU定量测定的结果相似。PA-824的EBA对所有4个剂量都相当，所有组的0～14 d平均每日痰菌量下降0.098 log10CFU·ml-1·d-1，治疗14 d的TTP总体每天平均增加了4.106 h，由于在试验的最低剂量下出乎意料地达到了最大疗效，因此，应该进一步探索PA-824在较低剂量下的杀菌活性，以确定EBA测量的该药物的剂量反应范围。第二项研究中，患者随机接受口服剂量为50 mg、100 mg、150 mg和200 mg的PA-824，结果显示，4组剂量水平的平均EBA之间差异无统计学意义。但在50 mg的剂量下，可以看出PA-824的疗效呈略低的趋势[33]。结合既往研究结果，可知PA-824在100～1200 mg 的广泛剂量范围内具有均匀活性。在未来的临床研究中，PA-824剂量在100～200 mg之间似乎是评估的最佳选择。最近的小鼠剂量分馏研究表明，PA-824的杀菌活性呈时间依赖性，且临床剂量的药代动力学模型与目前的研究结果一致，PA-824每日剂量低至100 mg将产生最大的杀菌效果[34]。

4.Q203：Q203通过抑制分枝杆菌细胞色素bc1复合物来抑制MTB细胞能量的产生。de Jager等[35]进行了一项为期14 d的研究，将Q203分为100 mg、200 mg和300 mg共3个剂量组，以标准治疗方案(R-H-Z-E，R：利福平；H：异烟肼；Z：吡嗪酰胺；E：乙胺丁醇)作为阳性对照组，EBA的大小用log10TTP来表示。对应的0～14 d的EBA分别为0.0036、0.0087和0.0135，标准治疗方案组对应的EBA为0.0207，且任何剂量下的Q203治疗均没有出现严重的药物不良反应。

5.AZD-5847：2009年12月，阿斯利康公司研制的该公司首个抗结核候选药AZD-5847进入Ⅰ期临床试验阶段。AZD-5847是一种对MTB具有体外活性的噁唑烷酮抗生素。Furin等[36]将AZD-5847分为4个剂量组：500 mg每日1次，500 mg每日2次，1200 mg每日1次，800 mg每日2次。结果显示，500 mg AZD-5847每天2次可使痰标本在固体培养基上的CFU下降0.039 log10CFU·ml-1·d-1，其余组别均未检测到杀菌活性；当用TTP来评估EBA时，在每天2次500 mg和每天2次800 mg的剂量下，其TTP明显增加，分别为每天1.24 h和1.21 h, 其他剂量的AZD-5847没有显示出明显的TTP增加。

四、 问题与展望

综上所述，EBA研究因受试人数较少，需时短，在抗结核新药研发的临床试验阶段成为一种快速而简易的人体药效学指标。但是EBA也存在一些局限性：第一，存在细菌和真菌污染问题，故最好使用选择性培养基进行EBA研究；第二，某些药物(如EMB)的剂量相关反应可能只有在较长的研究期间才会明显；第三，如果只研究前2 d的治疗，某些药物的活性就不会被检测到，如PZA的活性直到开始治疗大约4 d后才变得明显；第四，由于大多数EBA研究的受试者人数很少(每组通常在3～8例之间)，单个患者的去除会带来相当大的统计误差；第五，EBA只能检测易于咳出体外的病变处的MTB，而不能检测肉芽肿、结节和空洞壁的细菌，故不能很好地预测治疗失败和复发。新一代EBA试验(NCT02371681)正在评估正电子发射体层摄影(positron emmision tomography，PET)和CT在抗结核病新药早期快速评估中的潜在作用，优化EBA研究的方法学，以便丰富试验设计。随着方法学的进一步优化，EBA研究将对抗结核新药及新方案的Ⅱ、Ⅲ期临床试验研究具有重要的指导意义。